Wie Lichtinformation in die Zelle gelangen kann

Mechanismen der Photorezeption und mögliche Anwendungen für Phytochrome

  • Abb.1:  Überblick über den Photozyklus von Phytochromen. Die Pfr und Pr Zustände sind als repräsentative Oberflächenstrukturen dargestellt (Pfr Zustand (türkis) basierend auf der Wildtypstruktur von Agp2: PDB-Eintrag 6G1Y [6]; Pr Zustand (pink) basierend auf der Agp1 Struktur: PDB-Eintrag 5HSQ [7]. Änderungen in der Sekundärstruktur der “tongue” Region, welche im letzten Schritt der Aktivierung erfolgen, sind als Cartoon Darstellung hervorgehoben (Pfr: α-Helix - rot, Pr: β-Faltblatt - grün) [8]. Die Struktur des Chromophors Biliverdin ist sowohl oberhalb als auch unterhalb des entsprechenden Grundzustandes in einer der möglichen Resonanzstrukturen dargestellt.Abb.1: Überblick über den Photozyklus von Phytochromen. Die Pfr und Pr Zustände sind als repräsentative Oberflächenstrukturen dargestellt (Pfr Zustand (türkis) basierend auf der Wildtypstruktur von Agp2: PDB-Eintrag 6G1Y [6]; Pr Zustand (pink) basierend auf der Agp1 Struktur: PDB-Eintrag 5HSQ [7]. Änderungen in der Sekundärstruktur der “tongue” Region, welche im letzten Schritt der Aktivierung erfolgen, sind als Cartoon Darstellung hervorgehoben (Pfr: α-Helix - rot, Pr: β-Faltblatt - grün) [8]. Die Struktur des Chromophors Biliverdin ist sowohl oberhalb als auch unterhalb des entsprechenden Grundzustandes in einer der möglichen Resonanzstrukturen dargestellt.
  • Abb.1:  Überblick über den Photozyklus von Phytochromen. Die Pfr und Pr Zustände sind als repräsentative Oberflächenstrukturen dargestellt (Pfr Zustand (türkis) basierend auf der Wildtypstruktur von Agp2: PDB-Eintrag 6G1Y [6]; Pr Zustand (pink) basierend auf der Agp1 Struktur: PDB-Eintrag 5HSQ [7]. Änderungen in der Sekundärstruktur der “tongue” Region, welche im letzten Schritt der Aktivierung erfolgen, sind als Cartoon Darstellung hervorgehoben (Pfr: α-Helix - rot, Pr: β-Faltblatt - grün) [8]. Die Struktur des Chromophors Biliverdin ist sowohl oberhalb als auch unterhalb des entsprechenden Grundzustandes in einer der möglichen Resonanzstrukturen dargestellt.
  • Abb.2: Strukturelle Änderungen in einem bakteriellen Phytochrom durch Licht. (a) Strukturelle Überlagerung des Pfr Grundzustandes und des Meta Zwischenzustandes. Im dunklen Pfr Grundzustand sind das Biliverdin (BV) und die entsprechenden Aminosäureseitenketten dunkelgrau und Wassermoleküle als rote Kugeln dargestellt. Im Meta Zustand dagegen sind BV sowie das Protein orange dargestellt. Die gelben Pfeile zeigen die strukturellen Änderungen nach Belichtung des Phytochroms. (b) Bild zeigt das relevante Detailbild der Chromophorbindungstasche als Überlagerung des Pfr (schwarz [6]), Meta (orange [6]) und Pr (blau [7]) Zustandes. Aus dem Vergleich der strukturellen Daten kann das folgende Aktivierungsmodell aufgestellt werden [6]. Nach der (1) Photoisomerisierung des BV und damit einhergehenden Rotation am Ring D des Chromophors, erfolgt die Neuordnung der Wasserstoffbrückenbindungen zur Chromophorbindungstasche. Dieses wiederum (2) induziert die Reorientierung der Aminosäureseitenketten von Phe192 und Tyr165. Dadurch (3) wird ein Wassermolekül (rote Kugel) frei, welches begleitet ist von (4) einer strukturellen Änderung in Gln190. Die Umlagerung von Gln190 hat einen direkten Einfluss auf die Struktur der “tongue”. Im Pfr Zustand, ist das hochkonservierte Trp440 (Teil der “tongue”) zu dicht an der neuen Position des Gln190 (Meta Zustand). Der sterische Druck seitens des Gln190 bewirkt wahrscheinlich (5) eine Umlagerung des Trp440. Die strukturelle Änderung des Aminosäurenpaares Gln190 – Trp440 ist vermutlich ein initales Schlüsselereignis in der gesamten Umlagerung der „tongue“ während des Übergangs des Photorezeptors in den voll-aktivierten Pr Zustand.
Licht ist essentiell für das meiste Leben auf diesem Planeten. Es ermöglicht fundamentale Prozesse wie z. B. die Photosynthese, wobei Lichtenergie zusammen mit Kohlenstoffdioxid und Wasser in primäre Kohlenhydrate und Sauerstoff umgewandelt wird [1]. Reflektiertes Licht tritt durch die Pupille in unseren Augen und ermöglicht uns das Sehen [2]. Es steuert außerdem biochemische Prozesse wie z.B. den zirkadianen Rhythmus und die Beweglichkeit vieler Organismen auf der Erde [3].
 
Rotlicht-Photorezeptoren
Da sich die Lichtverhältnisse über den Tag und während der Jahreszeiten stetig ändern, ist es für fast alle Organismen wichtig, die vorliegenden Lichtverhältnisse zu kennen. Dieses wird realisiert mittels primärer Photorezeptoren. Phytochrome sind Rotlicht-Photorezeptoren in Pflanzen, Bakterien und Pilzen [4,5]. Sie beherbergen einen licht-sensitiven Chromophor, sogenannte Biline (offene lineare Tetrapyrrole), welcher über eine Aminosäure, dem Cystein, kovalent mit dem Protein verknüpft ist. Die Aktivierung des Photorezeptors mit Licht ist reversibel und lässt sich als Photozyklus beschreiben (Abb.1), welcher aus zwei Grund- oder Signalisierungszuständen (Pr und Pfr) und mehreren intermediären Zwischenzuständen (Lumi und Meta) besteht. Die beiden Grund- oder Signalisierungszustände können mittels ihrer anregbaren Wellenlängen in den Pr (rot aktivierbar) und Pfr (dunkelrot aktivierbar) Zustand unterschieden werden [5]. Entsprechend der Phytochrom Klasse, ist einer dieser Zustände im Dunklen vorherrschend [5]. Die Umwandlung der Phytochrome durch Licht ist gekoppelt mit der Aktivierung oder Deaktivierung von sich anschließenden zellulären Signaltransduktions-Prozessen [5]. Diese Kopplung findet im letzten Schritt des Photozyklus, während des Überganges vom entsprechenden Meta Zwischenzustand in den aktivierten Zustand, statt [8,9]. Es beinhaltet eine strukturelle Umlagerung in der sogenannten strukturellen Zungen Region („tongue“), welche den sensorischen Teil des Photorezeptors mit einem Ausgabemodul verbindet (Abb.1). Diese Änderung findet möglicherweise in vielen Phytochromen während der Photokonversion statt [6,8-11].

Daher sind strukturelle Daten des Meta Zwischenzustandes Voraussetzung für das Verständnis des molekularen Mechanismus der Lichtaktivierung von Phytochromen. Weiterhin ist die teilweise vorhandene intrinsische Fluoreszenz der Phytochrome von großem Interesse für die Optogenetik. Im Vergleich zu anderen fluoreszierenden Proteinen, ist die Wellenlänge, mit welcher Phytochrome angeregt werden können und welche sie anschließend emittieren von Vorteil, da diese mit dem sogenannten „Near Infra-red optical window“ einhergeht. Dieser Bereich ermöglicht z. B. in vivo das Veranschaulichen von tiefer gelegenen Geweben [12-14].

 
Mechanismus der Lichtaktivierung
Strukturelle Daten von Proteinen mit atomarer Auflösung können mit Hilfe verschiedener Methoden aufgenommen werden. Eine dieser Methoden ist die Röntgenstrukturanalyse. Hierbei werden zunächst ein oder mehrere Proteinkristalle erzeugt von denen anschließend mit Hilfe von Röntgenstrahlen Diffraktionsbilder aufgenommen werden. An Hand dieser Bilder ist es möglich Elektronenverteilungen (Elektronendichtekarten) zu ermitteln, die gleichzeitig die Atomlagen im Protein widerspiegeln und somit die 3D Struktur des Proteins als Durchschnitt aller im Kristall enthaltenen Proteinmoleküle zu bestimmen. Das gentechnisch fluoreszenz-optimierte Phytochrom Agp2-PAiRFP2 [6,12], welches aus dem bakteriellen Phytochrom Agp2 aus Agrobacterium fabrum [15] gewonnen wurde, konnte nun unter nicht aktivierbaren Lichtverhältnissen kristallisiert und strukturelle Daten vom nicht-aktivierten Pfr Grundzustand aufgenommen werden. Parallel dazu wurden einige Kristalle kontrolliert mit einem Klasse 3 Laser belichtet. Dadurch wurden erstmalig Strukturdaten eines Meta Intermediates aufgenommen. Abschließend wurden 3D Strukturmodelle errechnet und miteinander sowie mit anderen Strukturmodellen von Phytochromen, welche in der Protein Struktur Daten Bank (PDB) [16] abgelegt sind, verglichen. Diese Strukturdaten zusammen mit spektroskopischen Daten erlauben nun ein Modell zu erstellen für die initialen Schritte des molekularen Mechanismus wie Lichtinformation mit Hilfe eines Photorezeptors in zelluläre Information umgewandelt wird. Möglicherweise können diese Daten auch dazu beitragen allgemeine lichtgetriebene Mechanismen der Natur aufzuklären. Der Lichtaktivierungsprozess in Phytochromen kann in drei Hauptschritte unterteilt werden. Im ersten Schritt wird ein Photon der entsprechenden Wellenlänge vom Chromophor absorbiert und ermöglicht die Isomerisierung an einer spezifischen Doppelbindung im Bilin Molekül (Abb.1) [6]. In bakteriellen Phytochromen wie Agp2-PAiRFP2 ist der Chromophor Biliverdin (Abb.1, 2) [6]. Die Isomerisierung findet hier an der C15-C16 Doppelbindung statt. Aufgrund dessen dreht sich der Ring D um ungefähr 180° und ändert somit seine Wasserstoffbrückenbindungen mit der Chromophorbindungstasche. Diese ersten strukturellen Änderungen im Chromophor setzen sich über den gesamten Chromophor fort, so dass strukturelle Änderungen an allen vier Pyrrolringen sowie den Propionatseitenketten der Ringe B und C im Zuge der Lichtaktivierung beobachtet werden können (Abb.2). Die Relaxation des Chromophors in den aktivierten Zustand beeinflusst und wird beeinflusst durch die strukturelle Anpassung der Chromophorbindungstasche, welche im zweiten Schritt der Aktivierung geschieht. Hierbei erfahren beinahe alle Aminosäuren im Zuge der Lichtaktivierung eine strukturelle Änderung ihrer Seitenketten (Abb.2), während die Oberflächenstruktur sowie der Großteil der Sekundärstruktur des Proteins erhalten bleibt [6]. Zum Beispiel rotieren die Aminosäuren Arginin 211 sowie Arginin 242 und stabilisieren somit die neuen Konformationen der  Propionatseitenketten der Ringe B und C des Chromophors. Das Cystein 13 verändert im Zuge der Belichtung seine Orientierung zum Chromophor, wobei Teile des N-terminus des Proteins umgelagert werden. Die Seitenketten des Tyrosin 165 und Phenylalanins 192 werden reorientiert, um zusammen mit dem Ring D des Chromophors eine hydrophobe Bindungstasche zu formieren (Abb.2) [6]. Dabei wird ein Wassermolekül freigesetzt. Eine weitere Aminosäure Glutamin 190 wird ebenfalls dadurch frei, kann jetzt nach außen wegrotieren und gleichzeitig auf ihren Bindungspartner, das Tryptophan 440, sterisch Druck ausüben und dessen ursprüngliche Lage verändern (Abb.2) [6]. Tryptophan 440 gehört wiederum zur „tongue” Region, welche sich im letzten Schritt der Aktivierung des Photorezeptors derart umlagert, dass dort vermutlich aus einer α-Helix ein b-Faltblatt entsteht. In diesem Sinne stellt das Bindungspaar Gln190 – Trp440 einen Trigger für die Umfaltung der „tongue“ und damit des gesamten Photorezeptors dar [6]. Schlussendlich kann eine neue Faltung/ 3D Struktur des Photorezeptors von Bindungsproteinen in der Zelle erkannt werden, was dann zur Aktivierung von sich anschließenden Signaltransduktionswegen führt.
 
Mögliche Anwendungsbereiche
Basierend auf dem Vergleich der strukturellen Daten des Pfr und Meta Zustandes von Agp2-PAiRFP2 mit Phytochromen von weiteren Organismen in verschiedenen Stadien des Photozyklus konnten neue, allgemeine Strukturmotive sowie Bewegungen innerhalb des Proteins, welche notwendig sind, um diesen Photorezeptor zu aktivieren, aufgedeckt werden. Dieses erweitert unser Verständnis wie Signale aus der Umwelt in die Zelle übersetzt werden und ist Voraussetzung für die Anwendung von Phytochromen z. B. in der klinischen Forschung. Eine mögliche Anwendung liegt im Bereich der Optogenetik. In transgenen lebenden Mäusen konnte bereits gezeigt werden, dass das Phytochrom Agp2-PAiRFP2 Tumorzellen in tiefergelegenen Geweben darstellen kann [12,13]. Diese Anwendbarkeit beruht auf der intrinsischen Fluoreszenz einiger Phytochrome. Während in nativen Phytochromen die Quantenausbeute eher gering ist, konnte die Fluoreszenz in biotechnologisch veränderten Phytochromen um ein Vielfaches erhöht werden [12,13]. Da Phytochrome im roten bis infraroten Wellenlängenbereich fluoreszieren, können sie mit einem verbesserten Signal-Rausch Verhältnis in tiefere Gewebsschichten eindringen und diese nicht-invasiv verbildlichen. Eine weitere potentielle Anwendung könnten Phytochrome als licht-gesteuerte Werkzeuge zur Behandlung von genetischen Krankheiten auf molekularer Ebene finden. Um die Anwendbarkeit der Phytochrome jedoch zu verbessern, benötigen wir ein tieferes Verständnis der strukturellen Grundlagen der Fluoreszenz in diesen Proteinen und weitere strukturelle Untersuchen des kompletten Photozyklus auf atomarer Ebene.
 

Autoren
Andrea Schmidt 1§, Luisa Sauthof 1§, Michal Szczepek 1§, Patrick Scheerer 1

§ Autoren haben gleichwertig zu dieser Arbeit beigetragen.

Zugehörigkeit
1 Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

Kontakt
Dr. Patrick Scheerer

Institut für medizinische Physik und Biophysik
Charité - University Medicine
Berlin, Deutschland
patrick.scheerer@charite.de

 

Weitere Beiträge zur Photosynthese!

Literatur

[1] Blankenship RE (2001) Molecular mechanisms of photosynthesis. Blackwell, Oxford
[2] Fein A, Szuts EZ (eds) (1982) Photoreceptors: Their Role in Vision, Cambridge University Press, Cambridge
[3] Golombek DA, Rosenstein RE, Physiology of circadian entrainment. Physiol Rev, 2010. 90(3): p. 1063-102.
[4]  Butler WL, Norris KH, Seigelman HW, Hendricks SB. 1959. Detection, assay, and preliminary purification of the pigment controlling photoresponsive development of plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 1959 Dec;45(12):1703-8. PMID: 16590561
[5] Rockwell NC, Su YS, Lagarias JC. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annu Rev Plant Biol. 2006;57:837-58. PMID: 16669784
[6] Schmidt A, Sauthof L, Szczepek M, Lopez MF, Escobar FV, Qureshi BM, Michael N, Buhrke D, Stevens T, Kwiatkowski D, von Stetten D, Mroginski MA, Krauß N, Lamparter T, Hildebrandt P, Scheerer P. Structural snapshot of a bacterial phytochrome in its functional intermediate state. Nature Commun. 2018 Nov 21;9(1):4912. PMID: 30464203
[7] Nagano S, Scheerer P, Zubow K, Michael N, Inomata K, Lamparter T, Krauß N. The Crystal Structures of the N-terminal Photosensory Core Module of Agrobacterium Phytochrome Agp1 as Parallel and Anti-parallel Dimers. J Biol Chem. 2016. 291(39):20674-91. PMID: 27466363
[8] Takala H, Björling A, Berntsson O, Lehtivuori H, Niebling S, Hoernke M, Kosheleva I, Henning R, Menzel A, Ihalainen JA, Westenhoff S. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 2014 May 8;509(7499):245-248. PMID: 24776794.
[9] Burgie ES, Zhang J, Vierstra RD. Crystal Structure of Deinococcus Phytochrome in the Photoactivated State Reveals a Cascade of Structural Rearrangements during Photoconversion. Structure. 2016 Mar 1;24(3):448-57. PMID: 26853942
[10] Stojković EA, Toh KC, Alexandre MT, Baclayon M, Moffat K, Kennis JT. FTIR Spectroscopy Revealing Light-Dependent Refolding of the Conserved Tongue Region of Bacteriophytochrome. J Phys Chem Lett. 2014 Aug 7;5(15):2512-2515. PMID: 25126387
[11] Velazquez Escobar F, Piwowarski P, Salewski J, Michael N, Fernandez Lopez M, Rupp A, Qureshi BM, Scheerer P, Bartl F, Frankenberg-Dinkel N, Siebert F, Andrea Mroginski M, Hildebrandt P. A protonation-coupled feedback mechanism controls the signalling process in bathy phytochromes. Nature Chem. 2015 May;7(5):423-30. PMID: 25901821
[12] Piatkevich KD, Subach FV, Verkhusha VV. Far-red light photoactivatable near-infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome. Nature Commun. 2013;4:2153. PMID: 23842578
[13] Chernov KG, Redchuk TA, Omelina ES, Verkhusha VV. Near-Infrared Fluorescent Proteins, Biosensors, and Optogenetic Tools Engineered from Phytochromes. Chem Rev. 2017 May 10;117(9):6423-6446. PMID: 28401765.
[14] König K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy, 2000. 200(2): p. 83-104.
[15] Lamparter T, Krauß N, Scheerer P. Phytochromes from Agrobacterium fabrum. Photochem Photobiol. 2017 May;93(3):642-655. PMID: 28500698
[16] Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, Shindyalov IN, Bourne PE. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 2000 Jan 1;28(1):235-42. PMID: 10592235

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