Wie man einen Klon in einem Heuhaufen findet…

Vielseitige, einfache Multifragment DNA-Klonierung

  • Abb. 1: Die ZeBRα-Klonierung als “Flow-Diagramm”. Erläuterungen siehe Text. Abb. 1: Die ZeBRα-Klonierung als “Flow-Diagramm”. Erläuterungen siehe Text.
  • Abb. 1: Die ZeBRα-Klonierung als “Flow-Diagramm”. Erläuterungen siehe Text.
  • Abb. 2: Herstellung des “rekombinogenen” E. coli K12 -Lysates. Unten links sind schematisch die Komponenten des Lysates dargestellt für die eine Beteiligung in der Rekombination angenommen wird.
  • Abb. 3: Anwendungsmöglichkeiten und Effizienz der ZeBRα-Klonierung (a) PCR-Fragment ZeBRα-Klonierung. (b) Multifragment-ZeBRα-Klonierung in unterschiedliche Expressionsvektoren. (c) ZeBRα-Vektor Karte. (d) Anwendungsbeispiel 3-Fragment-ZeBRα-Klonierung. Ein für GFP kodierendes PCR-Fragment und ein Lac-Promoter wurden in den Vektor aus Abbildung 3D kloniert und die resultierenden grün fluoreszierenden Kolonien gezählt.
Klonierung ist einer der Säulen des molekularbiologischen Methodenrepertoires und es gibt keine Lebenswissenschaft, die ohne sie auskommt. Trotz ihrer scheinbaren Einfachheit sorgt sie häufig für Frustration und kann in Projekten zum “geschwindigkeitsbestimmenden Schritt” werden. Wir haben eine Methode entwickelt, die es erlaubt nahtlos mehrere DNA-Fragmente mit wesentlich reduziertem Arbeitsaufwand und Kosten in einen Plasmid-Vektor zu klonieren.
 
Unser ZeBRα-Verfahren (Zero Background Redα) zur Klonierung mehrerer DNA-Fragmente kombiniert ein E. coli Lysat aus einem K12-Stamm   mit einem “Zero-Background” Plasmid [1]. Das E. coli Lysat liefert die notwendigen Proteine für die in vitro Rekombination der DNA-Fragmente. Bei einer Linearisierung von Plasmid-Vektoren mit Restriktionsenzymen verbleiben immer unverdaute Plasmide in der Reaktion und werden mit-transformiert. Eine Vielzahl von Bakterienkolonien enthalten daher das ursprüngliche Plasmid ohne die gewünschten Insert-Fragmente. Dieser Hintergrund macht ein “screening” etlicher Kolonien auf das Vorhandensein der Insert-DNA im Vektor notwendig. Im Fall von sog. “Zero-Background”-Vektoren ist die Transformation des unveränderten Plasmids, ohne die gewünschte Insert-DNA tödlich für die Zelle. Dies wird durch das giftige Produkt des ccdB-Gens als Platzhalter vermittelt, welches im Verlauf der Klonierung durch die Insert-Fragmente im Plasmid ersetzt wird. Die Erfolgswahrscheinlichkeit liegt bei deutlich über 90 % bei der Klonierung mehrerer Fragmente.
Die beiden Methoden standen auch für die Namensgebung Pate. In der hier gezeigten Variante wird allerdings ein E. coli Stamm ohne Redα-Exonuklease verwendet [2].
In den letzten Jahren hat sich eine Reihe von Methoden etabliert [3], bei der mittels PCR-Primern 15-40 bp überlappende Sequenzen an den Enden der DNA-Fragmente angebracht werden, die fusioniert werden. Mit Hilfe einer Exonuklease wird je nach Enzym ein Strang an diesen Enden kontrolliert verdaut. Dadurch entstehen komplementäre Überhänge unabhängig von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.

Die komplementären Enden der DNA-Fragmente können hybridisieren und die Lücken werden nach der Transformation in E. coli von den endogenen Reparatursystem der Zellen geschlossen. In einigen Varianten werden die Lücken in vitro mit Hilfe von Polymerasen aufgefüllt und mittels einer Ligase zu einem kovalent geschlossenem Plasmidmolekül verknüpft [4].

Die zelleigenen Reparaturenzyme des E. coli K12 Stammes können diese Reaktionen auch sehr effizient in vitro wahrnehmen, wenn sie durch Lyse der Zellen mit einem milden, nicht-ionischen Detergens freigesetzt werden.
 
Der Ablauf der ZeBRα-Klonierung im Überblick
Für eine ZeBRα-Klonierung werden PCR-Fragmente mit Primern generiert, deren Enden 15-25 bp überlappen (Abb. 1, “Quadrate”). Ein Vektor mit dem ccdB-Gen als toxischen Platzhalter wird mit Restriktionsenzymen oder inverser PCR linearisiert, sodass das ccdB-Gen aus dem Vektor entfernt wird. Eine Gelreinigung ist nicht notwendig. Die PCR-Fragmente werden zusammen mit dem Vektor in 10-20 µl, 1x T4-Ligase-Puffer mit 26 µM NAD+ und 1 µl E. coli-Extrakt/10 µl für 30 Minuten bei RT inkubiert. Vektor und Insert werden bei einem Fragment im Verhältnis 3:1, bei mehreren Fragmenten äquimolar, in einer Größenordnung von 50-200 µg je Fragment eingesetzt. Die Reaktion wird anschließend über ein kommerzielles Silica-Säulenformat aufgereinigt und in chemisch kompetente E. coli transformiert (Abb. 1).
 
Die Herstellung des rekombinogenen E. coli Extraktes
Für die Herstellung des Extraktes eignen sich endA-recA-Mutanten von E. coli K12 Labor-Stämmen. Wir haben NEB 5-alpha und JM109 erfolgreich und mit hoher Klonierungseffizient eingesetzt. Es eignen sich laut Literatur jedoch weitere Labor-Stämme [5]. Eine Übernachtkultur wird 1:100 in 2x YT-Medium inokuliert und bis zu einer OD600 von ca. 2,3 bei 37°C und 250 rpm kultiviert. Anschließend werden die Zellen pelletiert, mit 1/6 des Kultur-Volumens in 1x PBS gewaschen und erneut pelletiert. Das gewogene Pellet wird in 1 % (w/v) Octyl-thioglucopyranosid (OTG) in 50 mM Tris-HCl pH 7,5 resuspendiert und für 10 min bei RT extrahiert (200 µl pro 0,07 g). Nach erneuter Zentrifugation (2 min) wird der Überstand in “low protein binding tubes” bei -70 °C gelagert.
 
Anwendungsmöglichkeiten und Ergebnisse der ZeBRα-Klonierung
Die offensichtlichen Vorteile dieser Methode sind neben der hohen Effizienz die bedeutende Einsparung an Zeit und Ressourcen. Die Methode eignet sich dafür, die beliebten aber teuren kommerziellen Kits zur Klonierung von PCR-Fragmenten zu ersetzen. Wie in Abbildung 3D gezeigt, lassen sich zwei Fragmente in den Vektor mit einer Effizienz von deutlich über 104 positiven Kolonien pro Mikrogramm eingesetzter DNA-Fragmente klonieren. Wir haben bis zu vier PCR-Fragmente in den in 3C gezeigten Vektor mit einer Effizient von ca. 7x 1000 Kolonien (nicht gezeigt) und gehen davon aus, dass die obere Grenze an Fragmenten die in einem Schritt kloniert werden können deutlich darüber liegt. Wir haben die ZeBRα-Klonierung der IVEC-Methode (In Vivo E. coli Cloning) gegenübergestellt. Bei IVEC werden die PCR-Fragmente zusammen mit dem linearisierten Vektor in E. coli K12 Zellen transformiert. Die endogenen Reparatur-/Replikationsmechanismen der Zellen setzen die linearen DNA-Fragmente zu einem Plasmidvektor zusammen.
Für zahlreiche Anwendungen wie der Herstellung transgener Organismen oder Vektoren für kultivierte Zellen ist es notwendig, die DNA-Sequenz an der man interessiert ist, in einem kleinen handlichen Plasmidvektor zu klonieren/manipulieren. Das Produkt wird anschließend in einen Vektor kloniert, welches Elemente für die Transgenese enthält z. B. Transposase-Erkennungsstellen und spezifische Markergene. Diese Sub-Klonierung wird durch die ZeBRα- Klonierung unnötig, da mehrere DNA-Fragmente in einem Schritt und unabhängig von Restriktionsenzymen direkt in den Transgenese-Vektor kloniert werden können. Die Methode eignet sich ebenfalls, um Fusionsproteine, Deletionsvarianten oder Punktmutationen zu erzeugen.
In den letzten Jahren haben sich kommerzielle, Rekombinase-basierte Klonierungs-Systeme für zahlreiche Modellorganismen stark verbreitet. Diese Systeme existieren für prokaryotische und eukaryotische Mikroorganismen ebenso wie für Zellkultur. Die Vektoren sind mit der ccdB-Kassette ausgestattet. Dadurch ist es möglich die in den Laboren vorhandenen “Destination”-Vektoren direkt mit dem hier beschriebenen E. coli-Extrakt zu verwenden.
 

Autoren
David Oliver Richter1 und Stefan Schuster1

Zugehörigkeit
1Abteilung für Tierphysiologie, Universität Bayreuth, Deutschland

Kontakt
Dr. David Richter
Lehrstuhl für Tierökologie I / Tierphysiologie
Universität Bayreuth
Bayreuth, Deutschland
david1.richter@uni-bayreuth.de

 

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Literatur
[1] Schefer, Q., Hallmann, S., & Grötzinger, C. (2014). Knockin’ on pHeaven’s Door: A Fast and Reliable High-Throughput Compatible Zero-Background Cloning Procedure. Molecular Biotechnology, 56(5), 449–458. https://doi.org/10.1007/s12033-014-9736-2
[2] Zhang, Y., Werling, U., & Edelmann, W. (2012). SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research, 40(8), e55. https://doi.org/10.1093/nar/gkr1288
[3] Chao, R., Yuan, Y., & Zhao, H. (2014). Recent advances in DNA assembly technologies.FEMS Yeast Research, 15(1). https://doi.org/10.1111/1567-1364.12171
[4] Gibson, D. G., Benders, G. A., Andrews-Pfannkoch, C., Denisova, E. A., Baden-Tillson, H., Zaveri, J., Smith, H. O. (2008). Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science , 319(5867), 1215–1220. https://doi.org/10.1126/science.1151721
[5] Motohashi, K. (2017). Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE) Method Using Cell Lysates from Laboratory Escherichia coli Strains and its Application to SLiP Site-Directed Mutagenesis (pp. 349–357). Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6472-7_23

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Universität Bayreuth


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