Zellen in Schläuchen

Miniaturisierung von in vitro-Kultivierungssystemen

  • Abb. 1: Module der Basisplattform. Linkes Bild: Mikrofluidischer Chip zum Generieren der Kompartimente. Abb. 1: Module der Basisplattform. Linkes Bild: Mikrofluidischer Chip zum Generieren der Kompartimente.
  • Abb. 1: Module der Basisplattform. Linkes Bild: Mikrofluidischer Chip zum Generieren der Kompartimente.
  • Abb. 1: Module der Basisplattform. Mittleres Bild: Coil eines  PTFE-Schlauches mit eingeschlossenen Kompartimenten zum Kultivieren und Lagern.
  • Abb. 1: Module der Basisplattform. Rechtes Bild: Alternative Methode zum Generieren von Kompartimenten: Zweifluidsonde.
  • Abb. 2: Prinzip des Gas- austausches zwischen den Kompartimenten und der das Schlauchsystem umgebenden Gasphase.
  • Abb. 3: Detektionsmodule. Links: Modul zur turbidimetrischen Bestimmung von Zellen im Kompartiment und zum Erfassen des gesamten Kompartiments.
  • Abb. 3: Detektionsmodule. Mitte: Modul zum Adaptieren an etablierte Spektrometer.
  • Abb. 3: Detektionsmodule. Rechts: Modul zum elektroimpedimetrischen Charakterisieren der Kompartimente.
  • Abb. 4: Turbidimetrische Charakterisierung der Größe und der Position eines Embryoid Bodys in einem Kompartiment [9]. Links: Embryoid Body nach einer Inkubationsdauer von 45 h (Bild 1 und das zugehörige Spannungssignal (Diagramm 1).
  • Abb. 4: Turbidimetrische Charakterisierung der Größe und der Position eines Embryoid Bodys in einem Kompartiment [9]. Rechts: der gleiche Embryoid Body nach einer Inkubationsdauer von 141 h (Bild 2) mit dem zugehörigen Spannungssignal (Diagramm 2).
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Ein Ziel von Zellkultivierungen ist das möglichst realistische Simulieren von in vivo-Bedingungen. Sehr oft sind einzelne oder einige wenige Zellen Ausgangspunkt solcher Prozesse. Herkömmliche Systeme wie z. B. Bioreaktoren sind jedoch für das Kultivieren einzelner oder weniger Zellen nicht geeignet. Einen Ausweg aus dieser Situation bietet die Miniaturisierung von in vitro-Kultivierungssystemen. Eine vielversprechende Technologie ist die des „segmented flow“, eine für Screeningprozesse bereits durchaus bekannte Technologie. Hier werden beispielhaft einige Ergebnisse der Anwendung dieser Technologie für die 3D-Zellkultivierung präsentiert.

nl-Bioreaktoren
Zur Entwicklung und Auswahl von Wirkstoffen beispielsweise für Tumortherapien werden vorzugsweise High-Throughput-Assays (HTS-Assays) auf der Basis von Mikrotiterplatten verwendet. Die Ergebnisse dieser in aller Regel als 2D-in vitro HTS-Assays genutzten Methoden sind jedoch nur eingeschränkt mit der tatsächlichen Reaktion von Tumorzellen in vivo vergleichbar. Aus diesem Grund ist es notwendig, 3D-in vitro Modelle zu entwickeln, die den in vivo Bedingungen möglichst nahe kommen. Als ein solches Modell können sogenannte „multizelluläre Sphäroide“ dienen. Gründe dafür, warum sich dieses Modell noch nicht umfassend etabliert hat, sind einerseits die Schwierigkeiten bei der reproduzierbaren Bildung und Expansion der Sphäroide. Andererseits fehlen einfache Techniken und Protokolle für einen schnellen und standardisierten Assay zur Bestimmung der zellulären Antwort einzelner Sphäroide auf die Zugabe von Wirkstoffen. Die Lösung dieser Diskrepanz kann ein neuartiges biotechnologisches Verfahren bieten, welches auf dem Prinzip des „segmented flow“ [1, 2, 3] basiert.
Das Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik (iba) hat eine technologische Plattform für die spezifische Kultivierung verschiedener Zelltypen bis hin zu multizellulären Systemen im nl- bis zum µl-Maßstab entwickelt. Diese als „pipe based bioreactors“ (ppb) etablierte Technologieplattform [4] ermöglicht es, in den in einem Mikrokanal (z.B.

einem PTFE-Schlauch, siehe
Abb. 1, mittleres Bild) seriell angeordneten Kompartimenten (= nl-Bioreaktoren) sowohl nicht adhärent wachsende als auch adhärent wachsende Zellen zu kultivieren. Adhärent wachsende Zellen bilden in diesen Kompartimenten unter bestimmten Voraussetzungen Sphäroide. Genau definierte Parameter garantieren die Bildung nur eines einzigen Sphäroids pro Kompartiment (Abb. 4, untere Bilder), was für Wirkstofftests grundlegende Vorteile bringt. Eine mit den Kompartimenten nicht mischbares Fluid, z. B. Perfluordekalin (PFD) dient einerseits als Trennfluid zwischen den Kompartimenten und verhindert das Fusionieren der Kompartimente. Andererseits dient es als Speicher für die Versorgung der Zellen mit O2.

Modulare Plattform
Basis dieser Plattform sind funktionelle Module, die sich entsprechend ihrer Funktion zu einem Gesamtsystem integrieren lassen [5]. Folgende Prozessschritte sind realisierbar:

  • Generieren von Kompartimenten unterschiedlicher Volumina (50 nl – 20 µl),
  • Vereinigen von Kompartimenten,
  • Zudosieren von Wirkstoffen zu den Kompartimenten,
  • Lagerung / Inkubation der Kompartimente,
  • Detektion auf der Basis von Mikroskopie und Spektroskopie (z. B. Turbidimetrie und Elektroimpedanzspektroskopie),
  • Splitten von Kompartimenten.

Alle Module sind sterilisierbar und damit für medizinische Fragestellungen geeignet. Grundlegende Funktionen lassen sich mit als „Disposables“ herstellbaren Modulen realisieren.
Die Kompartimente befinden sich nach deren Generierung (Chip-basiert mit dem im linken Bild der Abbildung 1 dargestellten Modul oder Sonden-basiert, rechtes Bild) in einem Schlauch aus Polytetrafluorethylen (PTFE). Je nach gefordertem Volumen der Kompartimente variiert der Innendurchmesser des PTFE-Schlauches zwischen 0,25 mm und 1,6 mm. Die hydrophoben Eigenschaften des Materials PTFE garantieren einerseits das reproduzierbare Generieren der Kompartimente und verhindern andererseits das Adhärieren der Kompartimente an der Schlauchinnenwand. Zusätzlich gewährleistet die Gaspermeabilität des PTFE-Schlauches eine ausreichende Versorgung der Zellen in den Kompartimenten mit O2 und CO2 (siehe Abb. 2), was durch die im Vergleich zu wässrigen Medien hohe Gasaufnahmekapazität des Trennfluids PFD zusätzlich unterstützt wird. Mit diesen Eigenschaften sowie der Möglichkeit, den PTFE-Schlauch vor dessen Verwendung im Autoklaven sterilisieren zu können, sind die Voraussetzungen für ein reproduzierbares Kultivieren von Zellen gegeben. Aufgrund seines Preises kann der Schlauch damit auch als „Disposable-High-Throughput-Bioreaktionssystem“ bezeichnet werden. Das Inkubieren des PTFE-Schlauches erfolgt im Inkubator unter den für die jeweilige Zellkultur notwendigen Bedingungen. Für Kultivierungen über Zeiträume von mehreren Tagen oder Wochen besteht die Möglichkeit, mit Hilfe eines Mediumaustauschmoduls einen Teil des verbrauchten Kulturmediums durch frisches Medium zu ersetzen. Damit ist das System für Fed-batch-Ansätze geeignet.

Detektion von Zellen und multizellulären Systemen
In der klassischen Bioprozesstechnik können Parameter wie pH, pO2 oder Temperatur in Bioreaktoren in situ problemlos gemessen werden. Mit Hilfe dieser und weiterer Parameter werden Rückschlüsse auf die Kinetik der Zellproliferation gezogen. Mit kleiner werdenden Bioreaktoren werden in situ-Messungen immer schwieriger, wenn nicht gar unmöglich. Dafür kann jedoch die Entwicklung der gesamten Zellpopulation in deren Mikroumgebung beurteilt werden, was in diesem Fall mittels mikroskopischer [6], spektroskopischer [7] oder auch elektroimpedimetrischer [8] Methoden möglich ist. Für diese Charakterisierungsmethoden stehen ebenfalls spezielle Module, adaptierbar an die unterschiedlichen Außendurchmesser des jeweils verwendeten PTFE-Schlauches, zur Verfügung (Abb. 3). Das Anschließen unterschiedlicher Lichtquellen und Detektoren an die spektroskopischen Module ist ebenso möglich wie das Anpassen für am Markt etablierte Spektrometer.
Abbildung 4 zeigt beispielhaft die turbidimetrische Messung der Proliferation eines Stammzellsphäroiden („Embryoid Body“) in einem Kompartiment mit einem Volumen von 20 µl. Die signifikanten Unterschiede der Spannungssignale (obere Bilder in Abbildung 4) spiegeln die Größenunterschiede des „Embryoid Body“ nach einer 96-stündigen Kultivierung (untere Bilder in Abb. 4) reproduzierbar wider. Mit der Möglichkeit zur Erfassung der Größe von Sphäroiden ist die Voraussetzung gegeben, morphologische Veränderungen an Stammzellsphäroiden, z. B. für die Grundlagenforschung, oder an Tumorsphäroiden, beispielsweise zum Test unterschiedlicher Chemotherapeutika und deren Konzentrationen, zu detektieren.

Zusammenfassung
Mit der hier vorgestellten technologischen Plattform steht eine geschlossene High-Throughput-Plattform für die in vitro-Kultivierung von Suspensionszellen sowie von adhärenten Zellen als Sphäroide zur Verfügung. Zusätzlich ist die Zugabe von Scaffolds für das Kultivieren adhärenter Zellen sowie die Möglichkeit von Co-Kultivierungen gegeben. Neben den Applikationen für die Stammzell- und Tumorforschung werden weitere Anwendungen auf den Gebieten des Immunisolierens von Fragmenten Langerhansscher Inselzellen [10] und des Kryokonsevierens von Zellkulturen gesehen [11].

Danksagung
Die Forschungsarbeiten wurden mit Mitteln des 7. Rahmenprogramms der EU (Fkz.: FP7-223011), des AiF im Zutech-Programm (Fkz.: 217 ZBR und 366 ZBG), der BMBF-Initiative „Biotechnologie 2020+“ (Fkz.: 031A161A) sowie des Freistaates Thüringen im Rahmen der iba-Vorlaufforschung gefördert.

Literatur
[1] Grodrian A. et al.: Biosens. Bioelectron., 19, 1421-1428 (2004)
[2] Funfak A. et al.: Lab Chip, 7, 1132–1138 (2007)
[3] Henkel T. et al.: Chem. Eng. J., 101, 439-445 (2004)
[4] Geschützte Marke „pbb“, Reg.-Nr. 305 04 226.
[5] Lemke K. et al.: J. Biotechnol. (2015) http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.11.040
[6]  Lemke K. et al.: Proc. 17. Heiligenstädter Kolloquium, 291-292 (2014)
[7]  Schemberg J. et al.: Eng. Life Sc., 9, 391-397. (2009)
[8] Karippai N. et al.: Int. Workshop on Impedance Spectroscopy,  27-28 (2014)
[9] EU-Projekt “HYPERLAB”, GA-No. FP7-223011.
[10] Wiedemeier S. et al.: Eng. Life Sc. 11, No. 2, 165–173 (2011)
[11] Wiedemeier S. et al.: Proc. 2. Workshop Mikro-Nano-Integration, 6-7. (2010)

Weitere Beiträge zum Thema:
http://www.git-labor.de/category/tags/bioprozesstechnik

Mehr Informationen:
http://www.git-labor.de/forschung/life-sciences-biotechnologie/3d-zellku...

Kontakt
Dr. Gunter Gastrock
Institut für Bioprozess- und
Analysenmesstechnik e.V.
Fachbereich Bioprozesstechnik
Rosenhof
Heilbad Heiligenstadt
gunter.gastrock@iba-heiligenstadt.de

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