Zellfreie Biotechnologie

Polymermikrogele als experimentelle Plattform

  • Abb. 1: Herstellung von Mikrogelen aus Emulsionstropfen in mikrofluidischen Reaktoren / Flusszellen. Eine wässrige Lösung von Polymer-Vorstufen (Monomeren, Makromeren) wird durch eine nicht-mischbare (fluorinierte) Ölphase in Tensid-stabilisierte Mikrotropfen überführt. Diese dienen als maßgeschneiderte Template zur Darstellung von Mikrogelen, gequollen im wässrigen Medium (→ Hydrogelpartikel). Dank mikrofluidischer Fabrikationstechniken lassen sich wesentliche physikochemische und mechanische Eigenschaften wie Größe, Form, Funktionalisierung, Abbaubarkeit, interne Struktur, Porosität und Elastizität genau einstellen.Abb. 1: Herstellung von Mikrogelen aus Emulsionstropfen in mikrofluidischen Reaktoren / Flusszellen. Eine wässrige Lösung von Polymer-Vorstufen (Monomeren, Makromeren) wird durch eine nicht-mischbare (fluorinierte) Ölphase in Tensid-stabilisierte Mikrotropfen überführt. Diese dienen als maßgeschneiderte Template zur Darstellung von Mikrogelen, gequollen im wässrigen Medium (→ Hydrogelpartikel). Dank mikrofluidischer Fabrikationstechniken lassen sich wesentliche physikochemische und mechanische Eigenschaften wie Größe, Form, Funktionalisierung, Abbaubarkeit, interne Struktur, Porosität und Elastizität genau einstellen.
  • Abb. 1: Herstellung von Mikrogelen aus Emulsionstropfen in mikrofluidischen Reaktoren / Flusszellen. Eine wässrige Lösung von Polymer-Vorstufen (Monomeren, Makromeren) wird durch eine nicht-mischbare (fluorinierte) Ölphase in Tensid-stabilisierte Mikrotropfen überführt. Diese dienen als maßgeschneiderte Template zur Darstellung von Mikrogelen, gequollen im wässrigen Medium (→ Hydrogelpartikel). Dank mikrofluidischer Fabrikationstechniken lassen sich wesentliche physikochemische und mechanische Eigenschaften wie Größe, Form, Funktionalisierung, Abbaubarkeit, interne Struktur, Porosität und Elastizität genau einstellen.
  • Abb. 2: DNA-funktionalisierte Mikrogele als experimentelle Plattform zur Durchführung zellulärer Funktionen (hier: Proteinsynthese) in zellfreier Umgebung (engl. CFPS). (OBEN) Mikrofluidische Darstellung von Mikrogelpartikeln aus Wasser-in-Ölemulsionstropfen. Die genetische Information zur Darstellung eines Proteins wird in Form von linearen DNA-Molekülen mit Makromeren und Quervernetzern in Mikrotropfen verkapselt, aus denen DNA-funktionalisierte Mikrogelpartikel hervorgehen. (MITTE) Fluoreszenzmikroskopische Dreikanalanalyse der eingekapselten, DNA-funktionalisierten Mikrogelpartikel. Obwohl die Mikrogele nicht über eine zellähnliche Membran verfügen, ist die Transkription und Translation der Mikrogel-immobilisierten DNA ausschließlich auf das Volumen der Hydrogelpartikel beschränkt. (UNTEN) Fluoreszenzmikroskopische Zweikanalaufnahme des hergestellten grün fluoreszierenden Proteins, welches von den DNA-funktionalisierten Mikrogelen gebildet wird.
  • Abb. 3: Mikrogele als experimentelle Plattform zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in einer zellfreien Umgebung. (A) Enzyme werden in der Polymermatrix kovalent, supramolekular oder durch ionische Wechselwirkungen immobilisiert. Durch Einstellung von Hydrophile / Hydrophobizität sowie Porosität bzw. Vernetzungsgrad der Mikrogele wird eine auf das jeweilige Enzym optimal abgestimmte Reaktionsumgebung bezüglich Reaktivität und Enzymfaltung geschaffen. (B) Mikroreaktor basierend auf Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) zur mikroskaligen Kontrolle von Reaktionsbedingungen in Enzym-funktionalisierten Mikrogele mit integrierten Heizelementen zur ortsaufgelösten Kontrolle von Temperatur. (C) Schematische Zeichnung des unter B gezeigten Mikroreaktors zur Durchführung gekoppelter enzymatischer Reaktionen basierend auf zwei enzymfunktionalisierten Mikrogel-Populationen. Integrierten Ventile zwischen den beiden Mikroreaktorbereichen erlauben die selektive Zu- und Abfuhr von Reaktanden. (D) Vergrößerte Sicht auf enzymfunktionalisierte Mikrogele (rot), einzeln immobilisiert in hydrodynamischen Fallen. Die Bildfolge zeigt die Anbindung eines fluoreszierenden Enzyms (grün) an die Hydrogelmatrix im Fluss vor der eigentlichen Nutzung der entsprechend funktionalisierten Hydrogelpartikel. (E) Enzymatische Umsetzung von Malonat zu Malonyl-CoA in Mikrogelen visualisiert anhand der Blaufärbung eines Pyrophosphat-sensitiven Molybdänkomplexes.

Hydrogele sind in Wasser gequollene, dreidimensionale Polymernetzwerke, die durch chemische oder physikalische Quervernetzung von Monomeren oder Makromeren / Präpolymeren entstehen. Dabei eignen sich auf biokompatiblen Polymeren basierende Hydrogele aufgrund der Möglichkeit eine Vielzahl physikochemischer Eigenschaften exakt einzustellen, als maßgeschneiderte Reaktionsumgebung für biotechnologische Anwendungen [1].

Spricht man von Mikrogelen, handelt es sich dabei gewöhnlich um sphärische Hydrogele, welche durch geeignete Herstellungsverfahren im Größenbereich zwischen 100 nm und 100 µm dargestellt werden. Klassisch findet deren Synthese durch Emulsions- oder Präzipitations-Polymerisation statt, jedoch entstehen hierbei Mikrogele, welche häufig eine hohe Dispersität hinsichtlich ihrer Größe aufweisen. Dank mikrofluidischer Fabrikationstechniken lassen sich solche dreidimensionalen Polymernetzwerke hochkontrolliert im Größenbereich zwischen 10 µm und 200 µm herstellen. Die Nutzung der Mikrofluidik erlaubt es hierbei wesentliche physikochemische und mechanische Eigenschaften der Mikrogele wie Größe, Form, Funktionalisierung, Abbaubarkeit, interne Struktur, Porosität und Elastizität genau einzustellen (Abb. 1). Dies geschieht durch die mikrofluidische Darstellung maßgeschneiderter Emulsionen – gewöhnlich Wasser-in-Öl-Tropfen – welche dann als Template zur Darstellung entsprechender Mikrogele dienen [2]. Seit der Etablierung erster tropfen-mikrofluidischen Flusszellen durch Thorsen et al. im Jahr 2001 wurde intensiv an der Weiterentwicklung von mikrofluidischen Systemen gearbeitet. So ermöglicht beispielsweise ein geeignetes Strömungsverhältnis von kontinuierlicher und disperser Phase eine hervorragende Kontrolle über die Größe der Emulsionstropfen bzw. der daraus resultierenden Mikrogele. Darüber hinaus kann durch Variation des Mikrokanalprofils bei einer Quervernetzung von Emulsionstropfen direkt im Mikrokanal, auch als „On-chip“-Vernetzung bezeichnet, die Form der Mikrogele von Sphären über Scheiben bis hin zu Stäbchen eingestellt werden. Die tropfenbasierte Mikrofluidik zeichnet sich weiterhin durch eine sehr schnelle und damit optimale Durchmischung von Reaktionskomponenten aus, so dass Polymernetzwerk-Heterogenitäten in Gelen minimiert werden.

Darstellung von Mikrogelen aus Biopolymeren

Für die Darstellung von Mikrogelen im Bereich der zellfreien Biotechnologie sind Biopolymere, wie etwa die Polysaccharide Hyaluronsäure und Heparin, besonders geeignet, da sich Netzwerke aus diesen biokompatiblen Materialien durch eine hohe Porosität auszeichnen, welche eine optimale Diffusion von Molekülen und Reaktanden innerhalb des Netzwerks und damit eine effiziente Reaktionsführung ermöglichen.

Entsprechende Mikrogele finden durch eine Vielfalt an möglichen Modifizierungen u.a. Anwendung in den Bereichen Zellverkapselung, Wirkstofffreisetzung aus Depots sowie zellfreie Biosynthese und enzymatische Kaskadenreaktionen. Dabei ermöglichen mikrofluidisch dargestellte Mikrogele beispielsweise die zellfreie Proteinsynthese (cell-free protein synthesis, CFPS) in einer zellähnlichen, maßgeschneiderten Reaktionsumgebung [3]. Gegenüber herkömmlichen, zellbasierten Techniken, werden auch solche Mikrogele entwickelt, die essentielle zelluläre Eigenschaften wie Größe, Form, innere räumliche Organisation sowie intrazelluläre Dichte als wesentliche Faktoren zur Manipulation und Optimierung biochemischer Reaktionen abbilden. Die normalerweise in vivo ablaufende Genexpression bestehend aus Transkription (DNA → mRNA) und Translation (mRNA → Protein) wird in Mikrogelen durch die Anbindung genetischer Information (DNA) zur Bildung eines Proteins an die Polymermatrix realisiert, und die zellfreie Proteinsynthese durch Beladung der DNA-funktionalisierten Mikrogele mit einem zuvor extrahierten Zell-Lysat initiiert (Abb. 2). Die Innovationskraft dieses Ansatzes zeigt sich darin, dass Mikrogele von komplexen Bioreaktionsmedien abgetrennt werden können und damit wiederverwendbar sind, sowie Reaktionsprodukte durch Einbau geeigneter Bindungspartner in situ in den Mikrogelen konzentriert werden können. Weiterhin lassen sich in zellähnlichen Mikrogelen auch zelltoxische Proteine synthetisieren sowie nicht-proteinogene Aminosäuren in die Proteinstruktur eingeführt werden. Außerdem konnte kürzlich gezeigt werden, dass sowohl die Reaktionskinetik auf Transkriptions- und Translationsebene sowie die Proteinausbeute herkömmlicher zellfreier Proteinsynthese in homogenen, makroskopischen Reaktionslösungen durch DNA-funktionalisierte Mikrogele übertroffen werden [4]. Eine aktuelle Herausforderung besteht nun in der großtechnischen Darstellung dieser Mikrogele.

Vorteile der zellfreien Biosynthese in Mikrogelen

Im Gegensatz zu lebenden Zellen, die einen signifikanten Teil ihres Energiehaushaltes zur Aufrechterhaltung ihrer Membran und überlebenswichtiger Funktionen aufwenden müssen, erlaubt die zellfreie Biosynthese in Mikrogelen nicht nur eine energieökonomisch optimierte Darstellung pharmakologisch wie technisch interessanter Proteine und Enzyme (z.B. Antibiotika) – insbesondere solcher, die zelltoxisch und somit mit konventionellen Methoden bisher nicht verfügbar sind. Im Rahmen des Leibniz Research Cluster (LRC) werden außerdem neuartige Wege zur Wirkstoffentwicklung mittels enzymfunktionalisierter Mikro-Produktionseinheiten auf Basis der eingangs beschriebenen Mikrogele erforscht [5]. Besonders die Klasse der Polyketide, zu denen etwa 30% aller bisher bekannten Wirkstoffe natürlichen Ursprungs gehören, liegt im Fokus der Forschung, da sie eine große Zahl von Antibiotika (z.B. Tetrazyklin), Antitumor-Therapeutika (u.a. Doxorubicin) oder Fungizide (z.B. Soraphen A) beinhaltet. Die Biosynthesen all dieser Verbindungen haben gemein, dass sie aus kleinen Molekülen bzw. Bausteinen wie Malonyl-CoA oder Acetyl-CoA aufgebaut werden. Um die Verfügbarkeit dieser teuren, jedoch essentiellen Bausteine zu verbessern, werden in diesem Zusammenhang Mikrogele entwickelt, die als zellähnliche Reaktionsplattform beispielsweise die Darstellung des Bausteins Malonyl-CoA durch Anbindung eines entsprechenden Enzyms an die Hydrogelmatrix erlauben. Besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Einstellung gerade solcher physikochemischen Eigenschaften der Mikrogele (u.a. Hydrophobizität, Porosität), die optimale Bedingungen für Funktion und Aktivität des angebundenen Enzyms gewährleisten. Durch Kombination von Mikrogelen, die mit verschiedenen Enzymen funktionalisiert sind, lassen sich einem Baukastenprinzip folgend zukünftig beliebig komplexe enzymatische Kaskadenreaktionen zur Darstellung von Synthesebausteinen sowie ganzer funktionaler Produkte (z.B. Polyketid-basierte Wirkstoffe) aufbauen.

Autoren
Nicolas Hauck1, Carola Graf1, Julian Thiele1

Zugehörigkeit
1Institut für Physikalische Chemie und Polymerphysik, Leibniz Institut für Polymerforschung e.V., Dresden, Deutschland

Kontakt 
Dr. Julian Thiele

Institut für Physikalische Chemie und Polymerphysik
Leibniz Institut für Polymerforschung Dresden e.V.
Dresden, Deutschland
thiele@ipfdd.de
https://thielelab.com

Referenzen
[1] J. Thiele: „Polymer material design by microfluidics inspired by cell biology and cell-free biotechnology”, Macromol. Chem. Phys. 2017, DOI: 10.1002/macp.201600429
[2] T. Heida, J. W. Neubauer, M. Seuss, N. Hauck, J. Thiele, A. Fery: „Mechanically defined microgels by droplet microfluidics”, Macromol. Chem. Phys. 2017, DOI 10.1002/macp.201600418
[3] J. Thiele, Y. Ma, D. Foschepoth, M. M. K. Hansen, C. Steffen, H. A. Heus, W. T. S. Huck: „DNA-functionalized hydrogels for confined membrane-free in vitro transcription/translation” Lab Chip 2014, 14, 2651-2656
[4] M. M. K. Hansen, S. Paffenholz, D. Foschepoth, H. A. Heus, J. Thiele, W. T. S. Huck: „Cell-like nanostructured environments alter diffusion and reaction kinetics in cell-free gene expression”, ChemBioChem 2016, 17, 228. DOI: 10/1002/cbic.201500560
[5] J. Thiele, G. Cuniberti: „Mikrofluidische Flusszelle, Verfahren zur Synthese von Biomolekülen in einer mikrofluidischen Flusszelle und Verfahren zur Herstellung einer mikrofluidischen Flusszelle“, DE 10 2015 113 887 B3

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Hohe Straße 6
01069 Dresden
Deutschland

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