Zelluläre Verteilung auf einer mesoskopischen Skala

Die Lichtblattfluoreszenz-Mikroskopie als neuartiges diagnostisches Werkzeug?

  • Abb. 1: Markierung einzelner neutrophiler Granulozyten, die als Reaktion auf eine Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R) in murines Herzgewebe eingewandert sind. Ihre Lage in der normal perfundierten Fernzone (cyanfarbene Punkte), in ischämischem (rote Punkte) oder geschädigtem Gewebe (gelbe Punkte) ist unterschiedlich farblich markiert. Die I/R-Verletzungszone (gelbes Volumen) unterhalb des Knotens (weiß) ist im Zusammenhang mit der Herzoberfläche (violett-transparent) dargestellt.Abb. 1: Markierung einzelner neutrophiler Granulozyten, die als Reaktion auf eine Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R) in murines Herzgewebe eingewandert sind. Ihre Lage in der normal perfundierten Fernzone (cyanfarbene Punkte), in ischämischem (rote Punkte) oder geschädigtem Gewebe (gelbe Punkte) ist unterschiedlich farblich markiert. Die I/R-Verletzungszone (gelbes Volumen) unterhalb des Knotens (weiß) ist im Zusammenhang mit der Herzoberfläche (violett-transparent) dargestellt.
  • Abb. 1: Markierung einzelner neutrophiler Granulozyten, die als Reaktion auf eine Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R) in murines Herzgewebe eingewandert sind. Ihre Lage in der normal perfundierten Fernzone (cyanfarbene Punkte), in ischämischem (rote Punkte) oder geschädigtem Gewebe (gelbe Punkte) ist unterschiedlich farblich markiert. Die I/R-Verletzungszone (gelbes Volumen) unterhalb des Knotens (weiß) ist im Zusammenhang mit der Herzoberfläche (violett-transparent) dargestellt.
  • Abb. 2: Automatisierte Segmentierung der Glomeruli (cyanfarben) innerhalb der Niere einer Maus. Es sind drei optische Schnitte mit unterschiedlicher Gewebetiefe dargestellt, die die endotheliale Anti-CD31-Färbung (magenta) darstellen.
Während biologische Prozesse und zelluläre Verteilungsmuster von Natur aus 3-dimensional (3D) sind, basieren die meisten Studien der Grundlagenforschung sowie histopathologische Tests in der klinischen Routine auf der Analyse repräsentativer zweidimensionaler Dünnschnitte. Eine vollständige Gewebeanalyse würde daher die Auswertung Tausender aufeinanderfolgender Schnitte pro Probe erfordern, was für Forschungsfragen zu teuer und fehleranfällig und in der Routinediagnostik nicht wirtschaftlich möglich wäre. In den letzten zehn Jahren wurden daher Gewebe-Clearing (TC) und 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) erfolgreich kombiniert, um ganze Organe mit zellulärer Auflösung in 3D zu untersuchen.
 
Analyseeinschränkungen und die Größe der 3D Organe
Bei der Untersuchung der Auswirkungen und immunologischen Konsequenzen z.B. eines Herzinfarktes bei Mäusen ist es wichtig, die Infarktparameter, wie etwa das Volumen der perfundierten (nicht betroffene Zone), ischämischen (gefährdete Zone) und geschädigten Bereiche zu quantifizieren. Während dies typischerweise mit dem weit verbreiteten Tetrazoliumchlorid (TTC)-Redox-Assay untersucht wird, bei dem die Herzen in 2 mm dicke Scheiben geschnitten werden müssen, liefert der Test keine Informationen über die zelluläre Identität oder die Lokalisierung von immunologischen Infiltraten, die mit dem betroffenen Gewebe assoziiert sind, obwohl dies funktionell sehr relevant ist. Andere Techniken, wie die Durchflußzytometrie, ermöglichen eine genaue Quantifizierung mehrerer zellulärer Untergruppen im gesamten Gewebe, wobei aber der Lokalisationskontext verloren geht. Histologische Dünnschnitte liefern einen Auszug aller Informationen über zelluläre Identität, Lokalisation und Quantität, aber es fehlt die Volumeninformation und damit der räumliche 3D-Kontext. Im Gegensatz dazu bietet TC in Kombination mit der LSFM Übersichten zur quantitativen Untersuchung der zellulären Verteilung und anatomischen Lage in ganzen Organen oder Tieren (Abb. 1). Mit diesem Ansatz ist es nun möglich, Regionen zu identifizieren, die während des Infarkts nicht perfundiert wurden, aber dennoch weniger Schaden erlitten haben als benachbarte geschädigte Bereiche im selben Herz [1].

Die Möglichkeit, Regionen innerhalb derselben Probe zu bestimmen, die unterschiedlich auf den gleichen Stimulus reagieren, stellt ein Tor zur Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und zur Erforschung neuer Behandlungsmöglichkeiten für menschliche Patienten dar.

 
Die Größe der Organe - die mesoskopische Herausforderung
Wenn man ganze Organe oder Organismen untersuchen möchte, ist es wichtig, sich die Ausdehnung der anatomischen Strukturen im Vergleich zu den einzelnen Zellen, die das funktionelle Organ oder ein immunologisches Infiltrat bilden, vor Augen zu führen. Ein einzelner neutrophiler Granulozyt (Volumen ca. 400 µm3), der z.B. bei einem Herzinfarkt in das Herz der Maus (ca. 360 mm3 Volumen) rekrutiert wird, ist vom Volumen her fast 109-mal kleiner als das umgebende Objekt. Aus der Sicht eines Immunologen ist es daher faszinierend zu untersuchen, wie einzelne Immunzellen es trotzdem schaffen, sich innerhalb des Organismus zu definierten Zielorten zu bewegen. Es sollen aber nicht nur die einzelne Zelle und ihre unmittelbare strukturelle Umgebung sichtbar gemachen werden. Gleichzeitig soll das gesamte Organ erfasst werden, um einen Eindruck vom mesoskopischen zellulären Verteilungsmuster verschiedener Immunzell-Typen als Reaktion auf einen Reiz, wie z.B. eine sterile Entzündung durch einen Herzinfarkt, zu erhalten. Dies ist dann vergleichbar mit dem Blick in jeden Stein der gesamten Cheops-Pyramide (2,6 x 106 m3) bei gleichzeitiger Suche nach dem vergessenen Sechserpack Bier (~2000 cm3) eines Touristen. Die technischen Voraussetzungen für schnelle volumetrische Gewebeaufnahmen sind daher ein großes Gesichtsfeld (FOV) bei relativ hoher Auflösung sowie die Beleuchtung und die gleichzeitige Erfassung des gesamten FOV. Dazu muss das Gewebe selbst durch einen vorherigen TC-Schritt möglichst transparent gemacht werden.
 
TC und LSFM für schnelle volumetrische Aufnahmen ganzer Organe oder Tiere
Die einzige bildgebende Technik, die diese Kriterien derzeit erfüllt, ist die LSFM, nach vorherigem TC, wobei die Grundlagen beider Methoden in diesen Übersichtsartikeln [2, 3] ausführlich behandelt werden. Die LSFM basiert auf dem Konzept der Ultramikroskopie, das 1903 von Siedentopf und Zsigmondy entwickelt wurde [4]. Diese mit dem Nobelpreis ausgezeichnete Methode basiert auf der Probenbeleuchtung senkrecht (90°) zum Beobachter/Objekt. Bei den heutigen Mikroskopen wird ein Laserstrahl durch eine Zylinderlinse in eine mikrometerdünne Lichtscheibe umgewandelt, die die gesamte Brennebene und das FOV des Detektorobjektivs und der Kamera innerhalb der Probe beleuchtet. Die Abbildung von Quadratzentimeter großen Gewebesegmenten ist dann ein schneller Prozess. Anregungs- und Emissionslicht muss jedoch bis zu einen Zentimeter dickes Gewebe passieren, daher muss dessen Brechungsindex homogenisiert werden, um den Intensitätsverlust und die Streuung des Beleuchtungs- und Emissionslichts zu reduzieren. Als Pionier der Gewebeklärung gilt Spalteholz, der bereits seit 1914 mit organischen Lösungsmitteln zur Organklärunng experimentierte, um seine Kenntnisse in der Anatomie vertiefen zu können [5]. Heute gibt es etliche TC-Ansätze, von denen einige die Proteindichte verändern, während andere Wasser und Lipide aus den Proben extrahieren. Letztendlich streben alle Protokolle danach, den Brechungsindex des Gewebes an den der endgültigen Bildgebungslösung, z.B. einen zuckerangereicherten wässrigen Puffer oder ein organisches Lösungsmittel, anzugleichen. Darüber hinaus müssen Lichtstörungen durch Pigmente wie Melanin oder Hämoglobin, durch die potentiell Schatten entstehen können, z.B. durch Bleichen mit Peroxiden entfernt werden. Für die Darstellung von Organen oder auch ganzer Tiere bietet die Clearing-Methode auf Basis organischer Lösungsmittel den Vorteil, dass die Proben durch die vorherige Probenentwässerung schrumpfen und aushärten. Dadurch sind sie leichter zu handhaben und große Proben können in relativ kleinen Probenhaltern abgebildet werden.
 
Die Kombination von TC und LSFM: Geschichte der mesoskopischen Bildgebung
Ultramikroskopie und TC wurden erst kombiniert, als geeignete Fluoreszenz-Markierungen verfügbar waren. Heute können Sonden wie z.B. fluoreszenzmarkierte Antikörper zur Markierung einer bestimmten Struktur eingesetzt werden oder gentechnisch veränderte Zielzellen aufgrund der Expression von fluoreszierenden Proteinen identifiziert werden. Vor der Markierung spezifischer Strukturen wurde 1993 die optische orthogonal-plane Fluoreszenz-Schnittmikroskopie (OPFOS) zur Abbildung der Gewebeautofluoreszenz der Innenohrschnecke des Meerschweinchens eingesetzt [6]. Im Jahr 2004 wurde die Selective Plane Illumination Mikroskopie (SPIM) eingeführt, um das grün fluoreszierende Protein (GFP) in natürlich transparenten Medaka- und Drosophila-Embryonen abzubilden [7]. Im Jahr 2007 kombinierten Dodt und Kollegen dann erstmals TC mit LSFM, um sowohl endogene als auch künstliche Fluoreszenzen abzubilden [8].
 
TC und LSFM sind anpassungsfähig und werden schnell populär
Eine PubMed-Suchanfrage für LSFM und SPIM ergab zwischen 2004 und 2020 mehr als 950 Publikationen, davon 28 im Jahr 2007 und bereits 147 in 2018. Die Fluoreszenzmikroskopie im Lichtblatt allein erbrachte mehr als 640 Publikationen, davon 115 allein im Jahr 2018. Die TC und LSFM wurde dabei vor allem bei entwicklungs- oder neurowissenschaftlichen Fragestellungen (letztere hier zusammengefasst [9]) zum „Connectom“ eingesetzt und lieferte hochauflösende Bilder von Dendriten [8] sowie die Visualisierung von differenziellen Färbungen einzelner Nervenzellen in einem großen Teil des Gehirns (Brainbow-Technologie [10], kombiniert mit LSFM [11] und Tetbow [12]). In jüngster Zeit wurden TC und LSFM jedoch auch eingesetzt, um ganze Mäuse zu klären und dadurch Mikrometastasen und neuronale Projektionen im gesamten Tier darzustellen [13, 14]. Andere Studien konzentrierten sich z.B. auf die frühe Entwicklungsbiologie des Menschen [15, 16], Nierenerkrankungen (Abb. 2) [17] oder die Knochenanatomie [18], während die untersuchten Proben von Organoiden [11] über Fruchtfliegen [8, 11] bis hin zu menschlichen Embryonen [15] und Biopsien [19] reichen.
 
Die LSFM hat ein großes Potenzial für diagnostische Zwecke
Aufgrund der Fülle der Proben und der quantitativen Natur der 3D-Analysen eignet sich die LSFM nicht nur für die Grundlagen- oder medizinische Forschung, sondern hat auch ein klares Potenzial für die klinische Diagnostik. Einsatzgebiete könnten in der Krebsdiagnostik liegen, bei der in Patienten mit metastasierenden Erkrankungen durch gründliches Scannen betroffene Gewebe zuverlässig identifiziert werden, anstatt sie durch die Analyse von nur wenigen willkürlich gesetzten Schnitten zu übersehen. Darüber hinaus verwenden einige Gruppen bereits Lichtblatttmikroskopie, um frische menschliche Biopsien einzuscannen und damit die Geschwindigkeit und Robustheit intraoperativer Analysen zu erhöhen [19, 20].
 
Fazit
In den letzten zehn Jahren wurden TC und LSFM zur Verbesserung unseres grundlegenden Verständnisses biologischer Proben auf der mesoskopischen Skala eingesetzt, was eine neue Sichtweise auf alte, unbeantwortete Fragen eröffnet. Nun wird das Potenzial von LSFM in der klinischen Diagnostik evaluiert. Die Entwicklung von robusten und schnellen Färbeverfahren mit mehreren gleichzeitig messbaren Kanälen (sog. Multiplexen), die mit der klinischen Routine kompatibel sind, sollte dabei eine Priorität in diesem kontinuierlich wachsenden Bereich haben.
 
 
Autoren
Simon F. Merz1 und Matthias Gunzer1,2
 
Zugehörigkeiten
1Institut für Experimentelle Immunologie und Bildgebung, Universitätsklinikum, Universität Duisburg-Essen, Essen, Deutschland
2Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften - ISAS -e.V., Dortmund, Deutschland

Kontakt
Prof. Dr. Matthias Gunzer

Universitätsklinikum Essen
Institut für Experimentelle Immunologie und Bildgebung
Essen, Deutschland
matthias.gunzer@uni-due.de
http://experimental-immunology.de/

Literatur
1. Merz SF, Korste S, Bornemann L, Michel L, Stock P, Squire A, et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nature Communications. 2019;10(1):2312. 10.1038/s41467-019-10338-2
2. Richardson DS, Lichtman JW. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 2015;162(2):246-57. 10.1016/j.cell.2015.06.067
3. Power RM, Huisken J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 2017;14(4):360-73. 10.1038/nmeth.4224
4. Siedentopf H, Zsigmondy R. Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikroskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik 10. 1903:1-39.
5. Spalteholz. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen: Nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leipzig: Hirzel. 1914.
6. Voie AH, Burns DH, Spelman FA. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 1993;170(Pt 3):229-36. 10.1111/j.1365-2818.1993.tb03346.x
7. Huisken J, Swoger J, Del Bene F, Wittbrodt J, Stelzer EH. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 2004;305(5686):1007-9. 10.1126/science.1100035
8. Dodt HU, Leischner U, Schierloh A, Jahrling N, Mauch CP, Deininger K, et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 2007;4(4):331-6. 10.1038/nmeth1036
9. Ueda HR, Ertürk A, Chung K, Gradinaru V, Chédotal A, Tomancak P, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020. 10.1038/s41583-019-0250-1
10. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 2007;450(7166):56-62. 10.1038/nature06293
11. Masselink W, Reumann D, Murawala P, Pasierbek P, Taniguchi Y, Bonnay F, et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development (Cambridge, England). 2019;146(3). 10.1242/dev.166884
12. Sakaguchi R, Leiwe MN, Imai T. Bright multicolor labeling of neuronal circuits with fluorescent proteins and chemical tags. Elife. 2018;7. 10.7554/eLife.40350
13. Cai R, Pan C, Ghasemigharagoz A, Todorov MI, Forstera B, Zhao S, et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature neuroscience. 2019;22(2):317-27. 10.1038/s41593-018-0301-3
14. Pan C, Schoppe O, Parra-Damas A, Cai R, Todorov MI, Gondi G, et al. Deep Learning Reveals Cancer Metastasis and Therapeutic Antibody Targeting in the Entire Body. Cell. 2019;179(7):1661-76.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.013
15. Belle M, Godefroy D, Couly G, Malone SA, Collier F, Giacobini P, et al. Tridimensional Visualization and Analysis of Early Human Development. Cell. 2017;169(1):161-73 e12. 10.1016/j.cell.2017.03.008
16. Puelles VG, Fleck D, Ortz L, Papadouri S, Strieder T, Bohner AMC, et al. Novel 3D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney Int. 2019;96(2):505-16. 10.1016/j.kint.2019.02.034
17. Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, Medyukhina A, Mann L, Brenzel A, et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J Am Soc Nephrol. 2017;28(2):452-9. 10.1681/ASN.2016020232
18. Grüneboom A, Hawwari I, Weidner D, Culemann S, Müller S, Henneberg S, et al. A network of trans-cortical capillaries as mainstay for blood circulation in long bones. Nature Metabolism. 2019. 10.1038/s42255-018-0016-5
19. Glaser AK, Reder NP, Chen Y, McCarty EF, Yin C, Wei L, et al. Light-sheet microscopy for slide-free non-destructive pathology of large clinical specimens. Nature Biomedical Engineering. 2017;1(7):0084. 10.1038/s41551-017-0084
20. Poola PK, Afzal MI, Yoo Y, Kim KH, Chung E. Light sheet microscopy for histopathology applications. Biomed Eng Lett. 2019;9(3):279-91. 10.1007/s13534-019-00122-y

 

Weitere Beiträge zum Thema

Mehr zum Tissue Clearing

Kontaktieren

Universitätsklinikum Essen Institut für Experimentelle Immunologie und Bildgebung


Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.