Zusammenführung von Workflows in der Metabolomik

Strategien zur Steigerung von Durchsatz, Selektivität und Abdeckung

  • Abb. 1: Herstellung der markierten internen Standards. Ein automatisierter Fermentationsprozess mit voller Kontrolle über die Inputvariablen ist die Grundlage des Verfahrens. Die Biomasse kann bei Bedarf mit reprozierbaren Eigenschaften hergestellt werden. Aus der uniform 13C (U13C) markierten Biomasse werden die gewünschten internen Standards aufgearbeitet. Diese können nun in der Massenspektrometrie zur Qualitätssicherung eingesetzt werden.
  • Abb. 2: HILIC-RP-MS Dual Autosampler Setup. A. Der instrumentelle Aufbau basiert auf zwei Pumpen, zwei Injektoren, zwei Säulen und zwei Zweiwegeventilen und ermöglicht die chromatographische Analyse von kleinen polaren Metaboliten auf einer HILIC Säule (0-11 min) und unpolaren Lipiden auf einer RP Säule (11-32min). B. Der Wechsel zwischen positiven und negativen Mode des Massenspektrometers ergibt eine noch größere Substanzklassenabdeckung über verschiedene Adduktionen.
  • Abb. 3: Signifikant regulierte Stoffwechselwege von differenzierten Fettzellen im Protein-Metabolit Netzwerk mittels OmicsNet [7]. Die Information regulierter Metabolite (gelb) und regulierter Proteine (rot) wurde in einem Protein-Metabolit Netzwerk verbunden. Außerdem wurden der Glycerophospholipid (grün) und der Insulin (blau) Metabolismus als zwei wichtige Stoffwechselwege markiert.

Im Zeitalter der postgenomischen Forschung, ist die Metabolomik die Wissenschaft der kleinen Moleküle. Dieses Feld ist für die analytische Chemie besonders spannend, da die Herausforderungen enorm sind, um dem Versprechen der Omics- Analytik gerecht zu werden. Tausende von chemisch / physikalisch sehr heterogenen Verbindungen, deren Konzentrationen über mindestens 8 Größenordnungen variieren, sollen sowohl identifiziert als auch quantifiziert werden. In der Tat ist es bis heute unmöglich die Gesamtheit des Metaboloms unter Verwendung nur einer Analysenmethode zu erfassen.

Analytische Methoden in der Metabolomik

Die Aufgabenstellungen für die Methodenentwicklung sind vielfältig und reichen von Steigerung der Anzahl des innerhalb eines analytischen Laufs erfassten Metaboliten, des Probendurchsatzes ganz generell, hin zur Aufgabe der Standardisierung. Die Diskussion über Harmonisierungsstrategien ist essentiell. Massenspektrometrische Methoden entwickelten sich in den letzten Jahrzehnten zur Basis der Metabolomik. Hierbei werden 2 Analysenstrategien unterschieden: (1) Die gezielte Analyse zur absoluten Quantifizierung zellulärer Metabolite und (2) die ungezielte Analyse, welche metabolische Fingerprints und Footprints von Zellen ermöglicht. Diese metabolischen Fingerabdrücke werden mittels hochauflösender akkurater Massenspektrometrie (MS) gemessen und durch elaborierte Datenauswertungsmethoden hinsichtlich ihrer molekularen Signaturen interpretiert bzw. zur relativen Quantifizierung/statistischen Analyse herangezogen. Dadurch ist es möglich Molekülmuster zu entdecken, welche mit bestimmten zellulären Zuständen korrelieren. Sowohl für die gezielte, als auch für die ungezielte metabolomische Analyse steht die Entwicklung von Strategien zur Verbesserung von Durchsatz, Selektivität und Abdeckung im Fokus. Gerade wenn geringe Probenmengen vorhanden sind, wäre es ideal qualitative und (absolut) quantitative Metaboliteninformation gleichzeitig zu erheben.

Isotopenmarkierte Standards für die Zusammenführung von Screening- und Quantifizierungs-Workflows

Für die quantitative MS Messung sind prinzipiell Standards notwendig um rückführbare (somit vergleichbare) quantitative analytische Verfahren zu etablieren.

Interne Standards haben den größten Nutzen, wenn sie eine hohe Analogie mit dem eigentlichen Zielanalyten aufweisen, aber trotzdem bei der Messung differenzierbar bleiben. Die größte Analogie und somit den perfekten internen Standard, stellen stabilisotopenmarkierte Moleküle dar. Diese weisen ein chemisch identes Verhalten auf, haben aber ein höheres Molekulargewicht als die Zielanalyten und sind somit mit Massenspektrometern unterscheidbar. Nach dem heutigen Stand der Technik werden solche Standards meist aufwendig durch organische Synthese erzeugt. Daher sind viele biologisch relevante Metabolitenstandards kommerziell nicht erhältlich oder extrem kostenintensiv. Die individuelle chemische Synthese kann durch in vivo Markierung von Organismen umgangen werden. Eine erfolgreiche Anwendung in der Metabolomik ist die Fermentation von Pichia pastoris mit uniform markierter 13C Glukose als einziger Kohlenstoffquelle [1]. Als Eukaryont teilt sich Pichia pastoris viele gundlegende Stoffwechselwege mit anderen höheren Organismen und durch die Markierungsstrategie können hunderte, isotopenangereicherte Metabolite (13C- Anreicherungsgrad > 99 %) gleichzeitig und kostengünstig hergestellt werden (Abb. 1). Das Verfahren stellt eine grüne Alternative zur organischen Synthese dar, da toxische Lösungsmittelabfälle von vielen einzelnen Syntheseschritten vermieden werden. Hochmarkierte polare Metabolitenstandards sind für die Standardisierung kommerziell bei einem Spin-off der Universität Wien erhältlich. Eine Erweiterung des in vivo Markierungsverfahrens in Pichia pastoris stellt Lipidome Isotope Labeling of Yeast (LILY) dar [2]. Mit der gezielten Extraktion von unpolaren Lipiden über LILY kann eine interne Standardisierung für die biologisch hochrelevante Metabolitengruppe der Lipide in komplexen Matrices wie humanen Plasma durchgeführt werden [3]. Interne hochmarkierte Metabolit/Lipid-Standards können gleichzeitig mit den Zielanalyten in Probenvorbereitung, Lagerung und Messung verwendet werden. Da die Zugabe des internen Standards die Fingerabdruck-Datenauswertung (Substanzidentifizierung und statistische Analyse) nicht beeinträchtigt, kann eine gleichzeitige gezielte und ungezielte Metabolomanalyse durchgeführt werden. Diese Herangehensweise ermöglicht die Zusammenführung von Screening- und Quantifizierungs- Workflows und somit auch eine Erhöhung des Probendurchsatzes [3,4]

Erweiterung der Metabolitenabdeckung: Kombinierte Analyse von polaren Metaboliten und apolaren Lipiden

Obwohl Lipide per Definition den Metaboliten zugeordnet sind, werden sie meist separat von kleinen polaren Metaboliten wie Aminosäuren oder Zuckern mittels MS/LC-MS analysiert, da Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln und eigene Elutionspuffer für die Chromatographie benötigt werden. Neue multidimensionale Chromatographieprozesse ermöglichen nun die Erweiterung der Metabolitenabdeckung durch kombinierte Metabolomik und Lipidomik Ansätze. Zum Beispiel können 2-phasige Extraktionen einer Probe innerhalb eines analytischen Laufs, parallel auf 2 chromatographischen Säulen mit Hilfe eines Dual-Autosamplers injiziert werden. Die Kombination von Umkehrphasenchromatographie- (RPC) und hydrophiler Interaktionschromatographie-Säulen (HILIC) mit hochauflösender Massenspektrometrie liefert dann orthogonale Analyteninformation innerhalb eines Laufs. Daher erweitert dieser Aufbau (Abb. 2) das chromatographisch erfassbare Polaritätsspektrum, ohne dabei eine Erhöhung der Analysendauer in Kauf nehmen zu müssen; im Idealfall können sowohl hydrophile, als auch sehr lipophile Komponenten (z.B. Lipide) einer Probe in ein und demselben Experiment qualitativ und quantitativ mittels LC-MS analysiert werden [5].

Zusammenführung verschiedener Omics-Strategien: LC-MS-basierte Multiomik

Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung von Durchsatz, Selektivität und Abdeckung ermöglicht die Kombination der Metabolomik mit anderen Omics-Strategien wie der Proteomik. LC-MS eignet sich besonders für die Multikomponentenanalyse komplexer Proben wegen der hohen Selektivität, der Möglichkeit eine große chemische Bandbreite an Molekülen aufzunehmen und einen weiten Konzentrationsbereich abzudecken. LC-MS basierte Omics-Strategien unter Verwendung von isotopenmarkierten Standards ermöglichen die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von tausenden Substanzen durch Erfassung der chromatographischen Retentionszeit, akkuraten Masse, Isotopologen- und Fragmentierungsmuster der Analyte. So wird es möglich, den zellulären Metabolismus sowie seine Änderungen zu verfolgen und multimolekulare Information zu erhalten (Abb. 3). Innovative Multiomik Prozesse finden Verwendung in der Systembiologie und können zur Beantwortung verschiedenster Fragestellungen beitragen wie zum Beispiel der Identifizierung von molekularen Änderungen in der Fettzelldifferenzierung [6].

Danksagung

Die Autoren danken der Universität Wien, dem Massenspektrometrie Zentrum und der Forschungsplattform Metabolomics. Foto Copyright: Martin Schaier

 

Autoren
Evelyn Rampler1, Gerrit Hermann2, Gunda Koellensperger1

Zugehörigkeiten
1Institut für Analytische Chemie, Fakultät für Chemie, Universität Wien, Österreich
2ISOtopic Solutions, Wien, Österreich

Kontakt
Dr. Evelyn Rampler/Prof. Gunda Köllensperger,

Senior Scientist/Vizedekanin
Institut für analytische Chemie,
Fakultät für Chemie, Universität Wien
evelyn.rampler@univie.ac.at/gunda.koellensperger@univie.ac.at
anchem.univie.ac.at/forschung-arbeitsgruppen/umweltanalytik/

Dr. Gerrit Herrmann
Geschäftsführer ISOtopic Solutions
Wien, Österreich
info@isotopic-solutions.com
isotopic-solutions.com/
 

Referenzen
[1] S. Neubauer, C. Haberhauer-Troyer, K. Klavins, H. Russmayer, M.G. Steiger, B. Gasser, M. Sauer, D. Mattanovich, S. Hann, G. Koellensperger, U13C cell extract of Pichia pastoris--a powerful tool for evaluation of sample preparation in metabolomics, J Sep Sci. 35 (2012) 3091–3105. doi:10.1002/jssc.201200447.
[2] E. Rampler, C. Coman, G. Hermann, A. Sickmann, R. Ahrends, G. Koellensperger, LILY-lipidome isotope labeling of yeast: in vivo synthesis of 13 C labeled reference lipids for quantification by mass spectrometry, Analyst. 142 (2017) 1891–1899. doi:10.1039/C7AN00107J.
[3] E. Rampler, A. Criscuolo, M. Zeller, Y. El Abiead, H. Schoeny, G. Hermann, E. Sokol, K. Cook, D.A. Peake, B. Delanghe, G. Koellensperger, A Novel Lipidomics Workflow for Improved Human Plasma Identification and Quantification Using RPLC-MSn Methods and Isotope Dilution Strategies, Anal. Chem. 90 (2018) 6494–6501. doi:10.1021/acs.analchem.7b05382.
[4] M. Schwaiger, E. Rampler, G. Hermann, W. Miklos, W. Berger, G. Koellensperger, M. Schwaiger, E. Rampler, G. Hermann, W. Miklos, W. Berger, G. Koellensperger, Anion-Exchange Chromatography Coupled to High-Resolution Mass Spectrometry: A Powerful Tool for Merging Targeted and Non-targeted Metabolomics, Anal. Chem. 89 (2017) 7667–7674. doi:10.1021/acs.analchem.7b01624.
[5] M. Schwaiger, H. Schoeny, Y. El Abiead, G. Hermann, E. Rampler, G. Koellensperger, Merging metabolomics and lipidomics into one analytical run, Analyst. 144 (2019) 220–229. doi:10.1039/C8AN01219A.
[6] E. Rampler, D. Egger, H. Schoeny, M. Rusz, M.P. Pacheco, The power of LC-MS based multiomics : Exploring adipogenic differentiation of human mesenchymal stem / stromal cells, (2019) 1–18.
[7] G. Zhou, J. Xia, OmicsNet: A web-based tool for creation and visual analysis of biological networks in 3D space, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W514–W522. doi:10.1093/nar/gky510.

 

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