Biomineralien und Biomaterialien

Untersucht durch Festkörper-NMR-Spektroskopie

  • Abb. 1: Silicatschale der Diatomee Stephanopyxis turris, rasterelektronenmikroskopische Aufnahme.Abb. 1: Silicatschale der Diatomee Stephanopyxis turris, rasterelektronenmikroskopische Aufnahme.
  • Abb. 1: Silicatschale der Diatomee Stephanopyxis turris, rasterelektronenmikroskopische Aufnahme.
  • Abb. 2: Oben: 29Si CP MAS NMR-Spektrum von Diatomeen- Biosilicat. Unten: 13C CP MAS NMR-Spektrum von Diatomeen-Biosilicat
  • Abb. 3: Schematische Darstellung des Aufbaus von Biomineralien als anorganisch-organisches Kompositmaterial.
  • Abb. 4: 800 MHz Festkörper-NMR-Spektrometer

Einer der faszinierendsten biochemischen Prozesse in der Natur ist die Biomineralisation, die Synthese von Mineralien durch lebende Organismen. Biomineralien sind in der Natur allgegenwärtig: In Zähnen und Knochen von Säugetieren, in Schneckenhäusern, Muschelschalen und Krabbenpanzern, Kieselalgen (Diatomeen), aber auch in Blättern und Getreidehülsen von höheren Pflanzen wie Reis.

Die meisten Biomineralien sind Verbundstoffe aus anorganischen und organischen Materialien, die oft in komplexen, hierarchischen Strukturen angeordnet sind. Der ausgefeilte Aufbau, die besonderen Eigenschaften und auch die Schönheit der sich ergebenden Strukturen (Abb. 1) beschäftigen Forscher seit langem. Das Verständnis der Strukturen liefert zum Einen wichtige Erkenntnisse für Biologie, Chemie und Medizin, zum Anderen sind die Prinzipien der Biomineralisation Vorlage und Inspiration für die Synthese künstlicher Werkstoffe [1].

Die analytische Chemie bietet ein vielfältiges Arsenal an Methoden zur Charakterisierung von Biomineralien, darunter Schwingungs- und Massenspektroskopie. Eine zunehmend wichtige Methode zur Untersuchung der Struktur und Dynamik fester Stoffe ist die Festkörper-NMR-Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance, NMR). Sie nutzt kurzreichweitige Wechselwirkungen, d. h. die Nahordnung, um Strukturinformation zu gewinnen und ist daher komplementär zu den Diffraktionsmethoden, welche eine kristalline Fernordnung voraussetzen.

Entwicklungen in der modernen Festkörper-NMR-Spektroskopie
Atomkerne mit einem von Null verschiedenen Kernspin sind NMR-aktiv, häufig untersuchte Kerne sind beispielsweise 1H, 13C, 15N, 31P und 29Si. In der Festkörper-NMR-Spektroskopie treten, im Gegensatz zu typischen Flüssigkeits- NMR-Experimenten, Linienverbreiterungen als Folge räumlich anisotroper Wechselwirkungen (magnetische Dipol-Dipol-Wechselwirkung, Anisotropie der chemischen Verschiebung, elektrische Quadrupolwechselwirkung für Spins größer 1/2) auf. Diese Linienverbreiterungen können durch schnelle Rotation der Proben um eine Achse, welche um den sog. magischen Winkel von 54,7 ° zur Richtung des B0-Felds geneigt ist, unterdrückt oder zumindest deutlich verringert werden.

Schnelles und ultraschnelles MAS (Magic Angle Spinning) mit Rotationsfrequenzen von inzwischen über 60 kHz bewirkt eine deutliche Verbesserung der spektralen Auflösung. Zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses und der spektralen Auflösung geht der Trend kontinuierlich zu stärkeren Magnetfeldern, derzeit bis zu einer Feldstärke von 23,5 T, entsprechend einer Protonenresonanzfrequenz von 1000 MHz. Abbildung 4 zeigt ein modernes Hochfeld-NMRSpektrometer. Seit einigen Jahren ist außerdem die Dynamic Nuclear Polarization (DNP) auch für Festkörper-NMR-Experimente in hohen Feldern zugänglich. Dabei wird Polarisation von Elektronenspins auf Kernspins übertragen, was die Signalintensitäten um zwei bis drei Zehnerpotenzen erhöht [2]. Auch die Anreicherung der NMR-aktiven Isotope in der Probe – etwa 13C oder 15N – erhöht die Nachweisempfindlichkeit weiter [1]. In Verbindung mit Techniken, welche die starken dipolaren Kopplungen zwischen Protonen unterdrücken, macht (ultra-)schnelles MAS auch die Aufnahme von Protonenspektren in Festkörpern möglich, die sonst nur sehr breite, kaum aufgelöste Signale zeigen [3]. Durch zweiund dreidimensionale Techniken können sich überlagernde Signale aufgelöst sowie räumliche Kopplungen bzw. Kopplungen über chemische Bindungen sichtbar gemacht werden [1]. Eine besondere Stärke der Festkörper-NMR-Spektroskopie ist außerdem die Möglichkeit zur Bestimmung räumlicher Abstände zwischen Atomen (auch in amorphen Proben) mit Hilfe von Techniken wie Rotational Echo Double Resonance (REDOR) [4].

Wegen dieser Vorteile ist die Festkörper- NMR-Spektroskopie inzwischen auch ein wichtiges Instrument zur Untersuchung von Biomineralien, was anhand zweier ausgewählter Beispiele demonstriert werden soll:

Calciumphosphat-Biomineralien: Knochen
Menschliche Knochen weisen nanokristallines Hydroxylapatit auf, welches in eine Matrix aus Collagen eingebunden ist. Die genaue Zusammensetzung der Mineralphase ist jedoch nicht-stöchiometrisch und enthält verschiedene Fremdionen [5]. Mittels 1H-31P Kreuzpolarisations-Experimenten (Cross-Polarization, CP) in Verbindung mit Infrarot-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Phosphationen des Hydroxylapatits zu einem geringen Teil durch Carbonationen ersetzt sind und die Mineralphase daher dem Carbonatoapatit vom Typ B ähnelt [6]. Auch der Gehalt an Hydroxylgruppen ist geringer als in reinem Hydroxylapatit. Dieser lässt sich mit analytischen Standardmethoden nur schwer bestimmen, da oft die Vorbehandlung der Proben das Ergebnis verfälscht. Zweidimensionale 1H-31P-Korrelationsexperimente erwiesen sich als zuverlässige Methode, um den Gehalt an Hydroxylgruppen im Knochenapatit zu ermitteln [5].

Die Bildung des Knochenmaterials ist ein komplexer Prozess. Wachstum bzw. Wachstumshemmung sowie die Anlagerung von Zellen an das Knochengewebe werden von verschiedenen extrazellulären Proteinen gesteuert. Die genauen Wirkmechanismen sind jedoch zum großen Teil noch nicht ausreichend verstanden. Die Hydroxylapatit-Kristallite im Knochen erreichen nur eine Dicke von 3 nm, die optimal für die mechanische Stabilität ist. Die Kristallitgröße wird vermutlich von Biomolekülen gesteuert, die sich durch spezifische Bindungen an die Oberfläche des Apatits anlagern und so eine weitere Kristallisation verhindern. Dazu gehört Statherin, dessen Struktur und Beweglichkeit nach Anlagerung an Hydroxylapatit-Oberflächen von Gibson et al. ausführlich untersucht wurden. Mit REDOR-Experimenten konnten die Abstände zwischen Phosphor-Atomen des Hydroxylapatits und Kohlenstoff-Atomen des Peptids bestimmt und ein Modell der Bindung von Statherin an der Mineraloberfläche erzeugt werden [7].

Eine Substanz, deren Bedeutung für die Knochenbildung offenbar lange unterschätzt wurde, ist Citrat, das zu etwa einem Gewichtsprozent im Knochen enthalten ist. Hu et al. konnten kürzlich Signale aus den 13C CP MAS NMR-Spektren verschiedener Säugetierknochen dem Citrat zuordnen und mittels REDOR die Abstände der C-Atome des Citrats zur Apatitoberfläche ermitteln. Sie berechneten, dass die Kristallitoberfläche zu etwa einem Sechstel von Citrat bedeckt ist und führten ein Spin-Austausch-Experiment durch, mit dem der Abstand zwischen den einzelnen Citratmolekülen zu ca. 1,5 nm bestimmt wurde. Daraus ergab sich ein Modell einer relativ dichten Anordnung von Citratmolekülen auf der Knochenapatit-Oberfläche [8]. Für Knochen- Implantate werden zunehmend poröse Calciumphosphate verwendet, auf deren Oberfläche sich knochenbildende Zellen (Osteoblasten) ansiedeln und den Knochen regenerieren können. Die Festkörper-NMR-Spektroskopie eignet sich auch zur Charakterisierung dieser Materialien sowie ihrer Einbettung in neu gebildetes Knochengewebe [9].

Silicat-Biomineralien: Diatomeen
Amorphes Silicat kommt hauptsächlich in einzelligen Organismen, Diatomeen und Radiolarien, in den Zellwänden vor, sowie in kleineren Mengen in Schwämmen und in einigen Pflanzen [1]. Diatomeen sind einzellige Algen und in praktisch allen Salz- und Süßwasserreservoirs der Erde verbreitet. Ihre Zellwände aus amorphem Silicat bilden zwei Halbschalen, welche die Zelle wie eine Hutschachtel umgeben. Dabei sind die Schalen nicht kompakt, sondern bilden regelmäßige, komplexe Strukturen mit Poren im Nanometer- bis Mikrometermaßstab (Abb. 1). Das Porenmuster ist speziesspezifisch, was darauf schließen lässt, dass der Aufbau der Silicatschale genetisch kontrolliert wird. Mit 29Si-Festkörper-NMR-Spektroskopie lässt sich die Aufnahme der Kieselsäure aus den umgebenden Medien sowie ihre weitere Prozessierung in der Zelle verfolgen (Abb. 2 oben). 13C-Festkörper-Spektren von gereinigten Silicatschalen zeigen zudem deutliche Signale von Polysacchariden und Proteinen (Abb. 2 unten). Man geht daher davon aus, dass wie auch bei den meisten anderen Biomineralien die Abscheidung des Silicats durch organische Moleküle gesteuert wird (Abb. 3) [1,10].

Zusammenfassung
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Festkörper-NMR-Spektroskopie in den vergangenen Jahren wichtige Beiträge zum Verständnis der Struktur und Bildung von Biomineralien auf atomarer bzw. molekularer Ebene geliefert hat. Die großen methodischen Fortschritte der vergangenen Jahre, zum Beispiel wachsende Magnetfeldstärken, zunehmende Probenrotationsfrequenzen und die Möglichkeiten moderner Hyperpolarisationsexperimente wie Festkörper- DNP werden zu einer weiteren Steigerung der Aussagekraft Festkörper-NMR-spektroskopischer Methoden auch auf dem Gebiet der Biomineralisationsforschung führen.

Referenzen
[1] Gröger C. et al.: Prog. Nucl. Mag. Res.Sp. 54, 54–68 (2009)
[2] Renault, M. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 2998 –3001 (2012)
[3] Amoureux J.-P. et al.: J. Magn. Res. 193, 305–307 (2008)
[4] Gullion T. J. et al.: J. Magn. Res. , 81, 196-200 (1989)
[5] Cho G. et al.: Science, 300, 1123-1127 (2003)
[6] Kaflak A. et al.: Solid State Nucl. Mag. 29, 345–348 (2006)
[7] Gibson J. M. et al.: J. Am. Chem. Soc. 128, 5364- 5370 (2006)
[8] Hu Y.-Y. et al.: PNAS 107(52), 22425–22429 (2010)
[9] Schulz J.: Calcif. Tissue Int. 80, 275–285 (2007)
[10] Brunner E. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. , 48, 9724 –9727 (2009)

Kontakt
Dorothea Schleuter
Susanne Ueberlein
Eike Brunner
Technische Universität Dresden
Fachrichtung Chemie und Lebensmittelchemie
eike.brunner@tu-dresden.de

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.