Nanocoating

Hightech-Brücke zur organischen Welt

  • Abb. 1: Selbst-assemblierter Monolayer zur chemischen Modifikation von Oberflächen – hydrophob oder hydrophilAbb. 1: Selbst-assemblierter Monolayer zur chemischen Modifikation von Oberflächen – hydrophob oder hydrophil
  • Abb. 1: Selbst-assemblierter Monolayer zur chemischen Modifikation von Oberflächen – hydrophob oder hydrophil
  • Abb. 2a: Künstlich erzeugte super-hydrophobe Oberfläche
  • Abb. 2b: Natürliche super-hydrophobe Oberfläche
  • Abb. 3: Cytophile Neuron-on-a-chip-Oberfläche durch Beschichtung mit per PA22-2 verbundenen SAMs
  • Abb. 4: Gelöste Nanopartikel aus Edelmetallen und Metalloxiden
  • Abb. 5: Glasplatte, die mit Gold-Nanopartikeln beschichtet und durch selbst-assemblierte Monolayer zum Binden spezifischer Biomarker funktionalisiert ist.
  • Abb. 6: Microwell-Trays gefüllt mit gelösten Gold- (rot) und Silber- (gelb) Nanopartikeln. Diese Nanopartikel können mit selbst-assemblierten Monolayern funktionalisiert werden, um spezifische Biomarker zu binden.

Biosensoren zur Diagnose von Prostatakrebs. Gehirnimplantate zur Behandlung der Parkinson'schen Krankheit. Nanopartikel im Blutstrom auf der Suche nach Tumorzellen: Aktuelle Entwicklungen der zukünftigen Medizin. Ihr Erfolg basiert auf einem effektiven Interface zwischen Biologie und Technologie. Funktionale Beschichtungen und Materialien in Nano-Dimensionen sind ein wichtiger Schritt auf diesem Weg.

Biomedizin - Interaktion in der Nanowelt
Der Einsatz von Nanopartikeln und Beschichtungen mit Strukturgrößen im Bereich organischer Funktionselemente wie Zellen und Neuronen eröffnet neue Wege zur Interaktion mit der biologischen Welt - und resultiert in zahlreichen neuen biomedizinischen Applikationen. Ein Beispiel dafür sind magnetische Nanopartikel: Sie binden selektiv an Tumorzellen in einer Blutprobe und transportieren sie zu einem geeigneten Sensor zur Bestimmung ihrer Konzentration.

Nanocoatings - spezifisch funktionalisierte Beschichtungen in Nanodimensionen - gelten als der Schlüssel für viele dieser biomedizinischen Applikationen, sei es in-vivo (innerhalb des Körpers, mit Implantaten) oder in-vitro (außerhalb des Körpers, bei der Analyse von Blutproben). Durch den Effekt des Nanocoating kann eine Oberfläche Wasser anziehend oder Wasser abstoßend werden. Das macht sie zu einem günstigen Environment für lebende Zellen, schützt sie gegen das Andocken unerwünschter Proteine, oder sie wird zur Andockstelle für spezifische Moleküle.
IMEC forscht intensiv auf dem Gebiet biomedizinischer Applikationen und hat in diesem Kontext ein Toolset für diverse Oberflächenbehandlungen und Nanobeschichtungen entwickelt. Die nachfolgende Beschreibung soll einen Einblick in die höchst interessanten physikalischen Eigenschaften und die Leistungsfähigkeit des Nanocoating vermitteln.

Hydrophobe und hydrophile Oberflächen
Hydrophobe wie hydrophile Oberflächen lassen sich technisch erzeugen. Das kann durch Beschichtung mit hydrophilen oder hydrophoben Chemikalien geschehen oder durch die Veränderung ihrer Oberflächenstruktur.

Eine weithin gebräuchliche Technik zur chemischen Modifizierung von Oberflächen besteht im Einsatz von selbst-assemblierten Monolayern (SAM).

Diese Technik involviert die Absorption organischer Moleküle mit spontaner Selbstorganisation und Ausbildung einer nur Nanometer dicken Oberflächenschicht. Für metallische Oberflächen (Gold, Silber, etc.) werden SAMs auf der Basis von Alkanthiol eingesetzt. Für oxidische Oberflächen (Siliziumdioxid, etc.), verwendet man silan-basierte SAMs. Durch Anschluss einer hydrophilen oder hydrophoben Endgruppe an die molekulare Alkanthiol- oder Silan-Struktur wird die Oberfläche entweder hydrophil oder hydrophob (Abb.1).

Eine weitere Methode, um eine Oberfläche hydrophil oder hydrophob zu machen, ist die Änderung ihrer Nanostruktur. So wird eine Oberfläche hydrophob, wenn man ihre Rauheit steigert, etwa durch Plasmaätzung.
Beide Techniken lassen sich kombinieren, um die so genannte Super-Hydrophobie zu erzielen (Abb. 2). Zunächst steigert die Plasmaätzung die Rauheit, gefolgt von der Deposition eines hydrophoben SAM.

Antifouling-Beschichtungen
Fäulnis organischer Materialien (biofouling) kann zu unerwünschten Anlagerungen von Zellen, Proteinen oder DNA an nicht-biologischen Oberflächen (etwa auf Implantaten oder Biosensoren) führen. In Biosensor-Applikationen ist dies ein häufig konstatiertes Problem, wenn Biofouling die vorgesehene Funktion des Biosensors stört. Das zeigt sich in einem Rauschsignal und kann in Messergebnissen mit „falschen Positiven" resultieren. Aus diesem Grunde werden auf den Oberflächen von Biosensoren spezifische, Fäulnis verhütende Beschichtungen eingesetzt.
Ein häufig eingesetzter Typ des Antifouling-Coating ist eine Protein-resistente Beschichtung auf der Basis von Polyethylenoxid (PEO). Dabei werden SAMs mit molekularen PEO-Endgruppen zur Oberflächenbeschichtung verwendet. Auf diese Weise lassen sich sowohl Metalle wie oxidische Oberflächen gegen nicht-spezifische Anlagerungen von Proteinen resistent machen.

Cytophobe und cytophile Oberflächen durch SAM
Lebende Zellen bevorzugen spezifische Oberflächen und weisen andere zurück. Diese Oberflächenbeschaffenheit wird als cytophil, bzw. cythophob bezeichnet. So wachsen bakterielle Zellen und vervielfachen sich bevorzugt auf einem Agar-Medium, das mit Nährstoffen angereichert ist. Auf metallischen Oberflächen hingegen sterben sie ab. Bei IMEC laufen Untersuchungen an lebenden Neuronen, die auf einer Chip-Oberfläche kultiviert werden, die Sensoren und Aktuatoren enthält. Damit lassen sich Signale chemischer und elektrischer Art, die von den Neuronen stammen, messen und sogar auslösen.

Eine der großen Herausforderungen dieser „Neuron-on-a-chip"-Systeme ist es, die Chipoberflächen hinreichend zellenfreundlich (cytophil) zu machen. Bislang werden dazu oft Poly-L-Lysine (Verbundkunststoffe, die die Adhäsion von Zellen und Proteinen über die Oberflächenspannung des Trägers steuern) eingesetzt. Im Gegensatz dazu setzt IMEC auf innovative Techniken der Oberflächenbeschichtung, die auf SAMs und einem Laminin-basierten Protein (PA22-2) beruhen. (Laminin ist ein Glykoprotein, das als Teil der Basalmembran die Zelladhäsion fördert.)
Der Einsatz des SAM-Effekts zur Optimierung der Adhäsion hat den Vorteil, dass das Protein sehr fest an der Oberfläche haftet. Diese Bindung bleibt auch erhalten, wenn eine positive oder negative Spannung an die Oberfläche angelegt wird. Das PA22-2 Peptid bindet spezifisch mit Integrin α6β1, einem Zellmembran-Protein in Neuronen. Dadurch haften die Neuronen sehr stark auf der Chipoberfläche. Außerdem fördert das PA22-2 Peptid das Herauswachsen von Neuriten aus dem Zellkörper des Neurons (Abb. 3).

Biomimetische Oberflächen
Die Fremdkörperabstoßung (foreign body reaction, FBR) ist eine natürliche Abwehrreaktion von Organismen. Charakteristisch dafür ist die Formation von Fremdkörper-Riesenzellen (foreign-body giant cells) oder die Verkapselung der körperfremden Objekte, sowie chronische Entzündungen. FBR kann die Funktion von Implantaten erheblich degradieren. So zeigen deren Elektroden eine erhöhte Impedanz, und Sensoren generieren falsche Resultate, weil das Blut in der Umgebung des Implantats von abnormaler Konstitution ist.

Für die Arbeit mit Implantaten werden Beschichtungen erforscht, die die FBR-Reaktion gegenüber dem Implantat unterdrücken. Durch weiche und schwammartige Beschichtungen auf den harten anorganischen Oberflächen der Implantate soll die menschliche Gewebestruktur nachgeahmt werden. Das soll den Körper dahingehend täuschen, dass er das Implantat nicht als fremdes Objekt erkennt. Für diesen „bio-mimetischen" Effekt lassen sich biokompatible Silikone und Polymere einsetzen. Zusätzliche Funktionalität ergibt sich für diese Beschichtungen durch den Zusatz entzündungshemmender Substanzen.

Elektrodenoberflächen mit niedriger Impedanz
In vielen Fällen müssen die In-vivo-Elektroden äußerst klein sein, etwa wenn sie als Gehirnstimulatoren oder zur Aufzeichnung von Signalen in spezifischen Gehirnarealen eingesetzt werden. Diese Miniaturisierung bringt eine unerwünschte Zunahme der Elektrodenimpedanz mit sich. Es ist aber möglich, Beschichtungen zu entwickeln, die die Elektrodenimpedanz verringern. Zu diesem Zweck lässt sich beispielsweise eine elektrochemische Deposition von Poly(3,4-ethylenedioxythiophen) (PEDOT) oder Iridiumoxid verwenden. Diese Beschichtungen erhöhen die Leitfähigkeit des Materials und vergrößern die effektive Oberfläche, indem sie eine zusätzliche Oberflächenrauheit erzeugen.

Bio-funktionalisierte Oberflächen

Nanopartikel sind von großer Bedeutung für die Medizin. Sie lassen sich in der medizinischen Bildverarbeitung einsetzen, oder zum Transport von Arzneistoffen innerhalb des Körpers, oder sogar zum Ausbrennen von Krebszellen. Der einzige Weg, sie dazu zu veranlassen, besteht in der Bio-Funktionalisierung ihrer Oberfläche für diesen spezifischen Zweck. Wenn magnetische Nanopartikel gezielt nur an die Tumorzellen im Blutstrom andocken sollen, muss man die Oberfläche dieser Nanopartikel mit einem biologischen Rezeptor beschichten, der spezifisch mit den Tumorzellen reagiert. Solche biologischen Rezeptoren können auf die Oberfläche der Nanopartikel durch selbst-assemblierte Monolayer aufgebracht werden.
Affinitätsbasierte Biosensoren existieren in mancherlei Gestalt, abhängig vom Transducer-Typ: plasmonische Biosensoren, magnetische Biosensoren, ladungs- und temperaturbasierte Biosensoren. Sie alle beruhen auf der Tatsache, dass die Zielmoleküle (etwa ein Marker-Protein für Krebs) spezifisch an die Oberfläche des Biosensors andocken müssen, und dass sich dieser Bindungsvorgang messen lässt - durch eine Änderung im Adsorption-Peak, der Temperatur, etc.. Um das Binden mit dem Zielmolekül zu erreichen, müssen die Rezeptor-Biomoleküle auf der Oberfläche des Biosensors immobilisiert werden. Auch hier besteht ein effizienter Weg im Einsatz selbst-assemblierter Monolayer. Es wurden unterschiedliche SAM-basierte Verfahren zur Immobilisierung von Antikörpern, DNA und anderen Biomaterialien auf Biosensor-Oberflächen entwickelt. Dies betrifft SAMs mit diversen Alkanthiol- und Silan-Substanzen auf Gold- bzw. Metalloxid-Oberflächen.

Gemischte SAMs bestehen aus Alkanthiolen unterschiedlicher Länge und Funktionalität. Lange Alkanthiol-Moleküle mit funktionalen Endgruppen lassen sich zur kovalenten Bindung des Rezeptor-Biomoleküls verwenden, während die kurzen Alkanthiol-Moleküle zur Stabilisierung der SAM-Layer eingesetzt werden. Außerdem lassen sich die kurzen Alkanthiole zur Verhinderung der nicht-spezifischen Adsorption anderer Biomaterialien als den Zielmolekülen einsetzen, und zwar durch die Verwendung von Endgruppen wie PEO. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, wenn man komplexe Proben wie Blut oder Urin analysiert.

Im Gegensatz zu gemischten SAMs haben vor-aktivierte SAMs den Vorteil, dass Biomoleküle an ihre Oberfläche gekoppelt werden können, ohne dass dazu zusätzliche Koppel-Reagenzien notwendig sind. Die Verwendung von Cyano- und N-Hydroxysuccinimid-Gruppen ist eine Alternative zu den gebräuchlichen Amino-, Aldehyd- und Kohlensäure-Koppelgruppen. So wurde der Antikörper für S100ββ an einen Cyano-Silan SAM gekoppelt. S100ββ ist ein Marker-Protein für die Schlaganfall-Detektion. Ein anderes Beispiel ist der Einsatz eines vor-aktivierten SAM mit N-Hy-droxysuccinimid PEO-Alkanthiol zur Detektion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA), einem Marker für Prostatakrebs. Diese Studien zeigten eine identische Wirkung wie mit gemischten SAMs, allerdings mit dem oben erwähnten Vorteil.

Für die meisten Applikationen geschieht die Modifikation der Oberfläche in zwei Schritten: (1) chemische Modifikation der Sensoroberfläche mit Alkanthiolen und (2) kovalente Bindung der Rezeptor-Biomoleküle. In bestimmten Applikationen ist die direkte Immobilisierung der Rezeptor-Biomoleküle auf der Oberfläche besser geeignet. Bei dieser direkten Immobilisierung werden die Rezeptor-Biomoleküle an das Alkanthiol gebunden, und zwar während der Synthese, also vor der SAM-Deposition. Aus der Vielzahl von verfügbaren Koppelmethoden ist die kovalente Bindung die am besten steuerbare und stabile Methode zur Immobilisierung der als Rezeptor-Biomolekül genutzten DNA-Stränge auf der Oberfläche von Biosensoren. DNA-SAMs können entweder direkt auf der Oberfläche gebildet werden, etwa wenn die DNA-Samples eine angehängte Thiol-Gruppe enthalten (direktes DNA-SAM), oder sie werden indirekt gebildet durch Bindung der DNA-Stränge an ein vorher erzeugtes SAM, unter Verwendung geeigneter Koppel-Reagenzien (indirektes DNA-SAM). Allerdings besteht die Gefahr eines Aktivitätsverlustes, da diese Reaktionen aus mehrfachen Schritten bestehen. Anders als bei der indirekten Methode setzt das direkte DNA-SAM keinerlei Oberflächenbehandlung voraus und bietet zahlreiche Vorteile in Bezug auf Einfachheit, Effizienz, geordneter Immobilisierung und Kosten. Deshalb stützen sich die meisten DNA-Biosensor-Studien auf Direkt-DNA-SAMs. Dieses Vorgehen wird nicht nur bei der Funktionalisierung von planaren Substraten bevorzugt, es wird oft auch zur Funktionalisierung von Nanopartikeln eingesetzt.

Bei gelösten Nanopartikeln aus Edelmetallen und Metalloxiden (Abb.4) bestimmt deren Größe, Konstitution und Form die Farbe der Lösung. Diese Parameter werden so abgestimmt, dass sie eine bestimmte Applikation am besten treffen. Derartige Nanopartikel lassen sich in optischen Biosensor-Applikationen einsetzen. Dabei werden die Nanopartikel mit solchen Biomolekülen funktionalisiert, die spezifisch mit dem Zielmolekül ankoppeln.

Fazit
Die Technik des Nanocoating lässt sich zur Beeinflussung und sogar Steuerung der Interaktion zwischen Materialien und Prozessen der biologischen und der nicht-biologischen Welt einsetzen. Dazu wurden Verfahren entwickelt, die Oberflächen mit hydrophoben/hydrophilen, cytophoben/cytophilen und Antifouling-Eigenschaften ausstatten, Resistenz gegen die Abstoßung von körperfremden Stoffen erzeugen, oder ihnen Bio-Funktionalität erteilen. Alle diese Techniken sind eine unabdingbare Voraussetzung bei der Entwicklung von Applikationen wie „Neurons-on-a-chip", Biosensoren und biomedizinische Implantate.

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