Polymermultischichtelektroden

Interferenzfreie Detektion von Analyten und effiziente Energiekonversionssysteme

  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Polymerdoppelschicht-H2ase-basierten Bioanode für die H2-Oxidation mit integrierter O2-Schutzschicht (a) und molekulare Strukturen der für die einzelnen Polymerschichten verwendeten Polymere (b). Die Abbildung wurde aus [4] adaptiert.Abb. 1: Schematische Darstellung der Polymerdoppelschicht-H2ase-basierten Bioanode für die H2-Oxidation mit integrierter O2-Schutzschicht (a) und molekulare Strukturen der für die einzelnen Polymerschichten verwendeten Polymere (b). Die Abbildung wurde aus [4] adaptiert.
  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Polymerdoppelschicht-H2ase-basierten Bioanode für die H2-Oxidation mit integrierter O2-Schutzschicht (a) und molekulare Strukturen der für die einzelnen Polymerschichten verwendeten Polymere (b). Die Abbildung wurde aus [4] adaptiert.
  • Abb. 2: Chronoamperometrische Messung einer Polymerdoppelschicht-H2ase-Bioanode aus Abb. 1 und die Leistungskurve der mit Glucose/O2 betriebenen BFC, die eine O2-tolerante, auf GOx-basierende Bioanode mit integrierter Lactatoxidase/KAT-Schutzschicht enthält. a) und b) zeigen deutlich den Effekt der aktiven Schutzschicht. Adaptiert aus [4,5].
Enzyme sind hocheffiziente Biokatalysatoren, die ein breites Spektrum an Umsetzungen biologisch relevanter Substanzen sowie die Aktivierung kleiner Moleküle katalysieren und somit wichtige Elemente im Metabolismus von Organismen darstellen. Redoxproteine stellen eine besondere Klasse von Enzymen dar, die Redoxreaktionen, d. h. Reaktionen, bei denen Elektrontransferprozesse involviert sind, katalysieren.
 
Dabei erlaubt die elektrische Anbindung dieser Enzyme an Elektrodenoberflächen, entweder in einem direkten Elektronentransferregime (Enzym kommuniziert elektrisch direkt mit der Elektrode) oder in einem mediierten Elektronentransferregime (Elektronentransfer wird durch einen Redoxmediator übernommen) und durch das Anlegen bestimmter Potentiale eine direkte Kontrolle über die katalytische Reaktion. Somit ermöglichen Enzyme die elektrochemische Produktion bzw. Umsetzung eines Substrates wie H2 für Energiespeicher- und Energiekonversionssysteme durch die Anbindung sogenannter Hydrogenasen oder die elektrochemische Quantifizierung wichtiger Analyten wie z. B. Glucose durch zuckerumsetzende Oxidasen (z. B. Glucoseoxidase; GOx).
Die hohe Aktivität von Enzymen macht diese zu geeigneten Biokatalysatoren bzw. Bioerkennungselementen für effiziente Energiekonversionssysteme und sensitive Sensoren. Allerdings ist die hohe Aktivität oft mit einer geringen intrinsischen Stabilität des Enzyms gegenüber Inhibitoren/Interferenzen verbunden. Zudem erstreckt sich die Selektivität der Enzyme oft auf eine ganze Stoffklasse (z. B. Zucker) und nicht, wie für Sensoren erwünscht, auf einen einzelnen Analyten. Beide Eigenschaften limitieren den Einsatz solcher Redoxproteine in technologischen Anwendungen, weshalb ein intelligentes, multifunktionales Elektrodendesign benötigt wird, das gleichzeitig eine aktive Schicht (Abb. 1a, blauer Bereich) sowie eine Schutzschicht (roter Bereich), die schädliche und interferierende Verbindungen eliminiert, aufweist.

Polymermultischichtsysteme für vollständig geschützte Hydrogenasen
In Vorarbeiten konnten die Autoren dieses Artikels zeigen, dass es möglich ist, O2-sensitive Hydrogenasen (H2asen) wie die [NiFe]- [1] oder die [NiFeSe]-H2ase [2], die als vielversprechende Alternativen für Edelmetallkatalysatoren in Brennstoffzellen gelten, vor O2 zu schützen.

Dies gelang, indem diese in O2 reduzierende viologen-modifizierte Niedrigpotentialpolymere (ein Bsp. ist in Abb. 1b gezeigt, P(N3MA-BA-GMA)-vio) eingebettet werden [1]. Dieses Einzelschichtsystem (Polymer/H2ase) verhindert zwar eine Deaktivierung des Enzyms, jedoch müssen für die O2-Reduktion an den reduzierten viologen-Spezies Elektronen aus der Wasserstoffoxidation verwendet werden, was zu einem reduzierten Stromausstoß des Systems führt [1,2] und somit auch die Leistung einer entsprechenden Biobrennstoffzelle (BFC, biofuel cell) vermindert. Es wird also nach Lösungen gesucht, die den Schutzmechanismus vom H2-Oxidationsprozess entkoppeln.
Aufbauend auf diesen Vorarbeiten wurden alternative Schutzmechanismen konzipiert, die von der katalytisch aktiven Schicht entkoppelt sind, um so die Hydrogenase vollständig zu schützen und einen Stromeinbruch in Gegenwart von O2 zu vermeiden.
Ein effizienter Weg, um eine O2-freie Umgebung zu generieren, stellt die Verwendung bienzymatischer Reaktionskaskaden basierend auf einer Oxidase und Katalase (KAT) dar [3]. Dabei katalysiert die Oxidase die Oxidation eines Substrats, z. B. Glucose im Fall von GOx, bei gleichzeitigem Verbrauch von O2 (Gl. 1). Letzteres ist der natürliche Elektronenakzeptor für die Oxidase. Entstehendes H2O2 wird dann in einer Disproportionierungsreaktion durch KAT in unschädliches H2O und ein halbes Äquivalent O2 überführt (Gl. 2). Somit wird in jedem katalytischen Zyklus ½ O2 eliminiert (Gl. 3).
 

Oxidase
Substrat + O2 → Produkt + H2O2 (1)
 
Katalase
H2O2 → H2O + ½ O2 (2)
 
Gesamtreaktion
Substrat + ½ O2 → Produkt + H2O (3)
 
Wird dieses O2-Entfernungsystem in einer BFC eingesetzt, ist eine Immobilisierung der einzelnen Komponenten unabdingbar, da nur so eventuelle Nebenreaktionen an der Gegenelektrode vermieden werden. Zu diesem Zweck wurde ein Redox-inaktives, aber stark hydrophiles Polymer (P(SS-GMA-BA), Abb. 1b) in das System integriert, das als gut solvatisierte Immobilisierungsmatrix für die Oxidase und KAT dient [4]. Der Aufbau der auf H2ase basierenden geschützten Bioanode folgt einem Polymermultischichtansatz bestehend aus einer unterliegenden aktiven H2ase (([NiFe]- oder [NiFeSe]-H2ase)/Redoxpolymerschicht und einer darüber liegenden O2-Entfernungsschicht, die die zuckerumsetzende Oxidase, GOx, und KAT enthält (Abb. 1a). Wird nun dem H2-Gasstrom O2 zugesetzt (5 %) zeigen die Polymermultischichtbioanoden im Gegensatz zu Elektroden, die nur mit einem H2ase/Redoxpolymer-Layer ausgestattet sind, den erwünschten konstanten Stromfluss (Abb. 2a) [4].
Die Langzeitstabilität der Bioanoden konnte durch die Verwendung von Pyranoseoxidase anstelle von GOx in der Schutzschicht deutlich erhöht werden, da diese spezielle Oxidase, im Gegensatz zu GOx, ein inertes Produkt generiert und somit keine Nebenreaktionen auftreten, die die Aktivität der Bioanode beeinflussen. Dies zeigt deutlich, dass für die Stabilität der Elektrode nicht nur die Elektrodenarchitektur, sondern auch die Art der verwendeten Enzyme in der Schutzschicht von entscheidender Bedeutung ist.

Eine Glucose/O2-BFC basierend auf einer O2-toleranten GOx/Polymer-Bioanode
Da der Schutzmechanismus im vorliegenden Fall unabhängig von der aktiven Schicht arbeitet, sollte es möglich sein, dieses Konzept auch auf andere, enzymbasierte, O2-sensitive Systeme zu übertragen. GOx stellt ein sehr aktives, kostengünstiges und robustes Enzym dar, das bereits als Katalysator für die Herstellung vieler Glucose/O2-BFC verwendet wurde. Da allerdings O2 für GOx als natürlicher Elektronenakzeptor fungiert, ist der Bau einfacher, membranfreier BFCs erschwert. Um dem entgegenzuwirken, werden üblicherweise O2-tolerante, aber dadurch auch z. T. komplexere, Enzyme wie Dehydrogenasen verwendet. Um jedoch eine nutzbare Leistung einer BFC zu erhalten, muss unabhängig vom Enzym ein Niedrigpotentialmediator verwendet werden, der als Katalysator für die O2-Reduktion fungiert und somit die Leistung des Systems verringert. Durch die Kombination der Oxidase/KAT-Schutzschicht mit einer aktiven Redoxpolymer/GOx-Schicht konnte eine O2-tolerante Bioanode aufgebaut werden, die in Kombination mit einer auf Bilirubinoxidase basierenden Biokathode in einer membranfreien BFC eingesetzt werden konnte, die an Luft betrieben werden kann [5]. Als Oxidase für den O2-Schutz wurde Lactatoxidase verwendet. Diese setzt, in Gegenwart von O2, Lactat zu Pyruvat um. Somit stellt diese Bioanode ein attraktives System für implantierbare Sensoren dar, da Lactat in ausreichender Konzentration im Blut vorhanden ist.

Interferenzfreie Detektion von Lactose
Aus Gl. 3 wird ersichtlich, dass das bienzymatische System nicht nur O2, sondern auch das Substrat der Oxidase entfernt. Somit wurde die Schutzschicht mit einem auf Cellobiosedehydrogenase (CDH) basierenden Lactosesensors kombiniert, der es ermöglicht, Lactat in Milchprodukten in Gegenwart von Glucose zu detektieren [6]. Dies ist wichtig, da CDH ebenfalls eine Aktivität gegenüber Glucose zeigt und diese aufgrund des enzymatischen Spaltungsprozesses von Lactose in ihre Bestandteile Galactose und Glucose während des Produktionsprozesses in großen Mengen in lactosefreien Produkten vorliegt. Der entwickelte Sensor kann Lactose im µM-Bereich detektieren, auch bei Glucosekonzentrationen von bis zu 140 mM [6].

Zusammenfassung
Polymermultischichtbioelektroden, die mit einer aktiven Schicht sowie mit einer gezielt abgestimmten Schutzschicht versehen sind, führen zu erhöhten Leistungen in Energiekonversionssystemen (z. B. H2- oder Glucoseoxidation in BFCs) und interferenzfreier Detektion mit amperometrischen Biosensoren. Aufgrund der Entkopplung der aktiven von der schützenden Schicht kann angenommen werden, dass dieses Schutzkonzept auf jede Art von sensitiven Katalysatoren übertragen werden kann. Zudem können durch den Einbau weiterer Biokatalysatoren in die hydrophilen Polymerschichten Enzymkaskadenreaktionen zugänglich werden, die die Funktion der aktiven oder der Schutzschicht weiter steigern können.

Autoren
Julian Szczesny1, Felipe Conzuelo1, Adrian Ruff1
 

Zugehörigkeit
1Analytische Chemie - Zentrum für Elektrochemie (CES), Fakultät für Chemie und Biochemie, Ruhr-Universität Bochum, Bochum

Kontakt

Dr. Adrian Ruff
Analytische Chemie
Zentrum für Elektrochemie (CES)
Fakultät für Chemie und Biochemie
Ruhr-Universität Bochum
Bochum, Deutschland
adrian.ruff@ruhr-uni-bochum.de

Literatur

[1] N. Plumeré, O. Rüdiger, A. A. Oughli, R. Williams, J. Vivekananthan, S. Pöller, W. Schuhmann, W. Lubitz, Nat. Chem. 2014, 6, 822, DOI 10.1038/NCHEM.2022.

[2] A. Ruff, J. Szczesny, S. Zacarias, I. A. C. Pereira, N. Plumeré, W. Schuhmann, ACS Energy Lett. 2017, 2, 964, DOI 10.1021/acsenergylett.7b00167.

[3] N. Plumeré, Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 3731, DOI 10.1007/s00216-013-6827-z.

[4] A. Ruff, J. Szczesny, N. Marković, F. Conzuelo, S. Zacarias, I. A. C. Pereira, W. Lubitz, W. Schuhmann, Nat. Commun. 2018, 9, 3675, DOI 10.1038/s41467-018-06106-3.

[5] F. Lopez, S. Zerria, A. Ruff, W. Schuhmann, Electroanalysis 2018, 30, 1311, DOI 10.1002/elan.201700785.

[6] F. Lopez, S. Ma, R. Ludwig, W. Schuhmann, A. Ruff, Electroanalysis 2017, 29, 154, DOI 10.1002/elan.201600575.

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https://www.git-labor.de/category/tags/Materialforschung

 

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