Von der Mikroskopie zur Superauflösungsmikroskopie

Fortschritte in der Mikroskopie ermöglichen die optische Erkundung neuer Dimensionen

  • Vergleich Konfokal- mit Supercontinuum-STED Mikroskopie am Beispiel Vimentin.  Quelle: Dr. Lars Kastrup Department of NanoBiophotonics Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, GöttingenVergleich Konfokal- mit Supercontinuum-STED Mikroskopie am Beispiel Vimentin. Quelle: Dr. Lars Kastrup Department of NanoBiophotonics Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen

Dynamik, Messbereich und Auflösung - das sind grundlegende Problem­stellungen, mit denen sich Physiker und Ingenieure seit der Entwicklung der Mikroskopie befassen. Verbesserungen in diesen Bereichen führen zu einer Erschließung neuer Blickwinkel im Mikro- und Nanokosmos. Moderne Mikroskope sind modulare hochintegrierte bildgebende Systeme, die reproduzierbare Experimente, das Messen quantifizierbarer Größen und deren statistisch abgesicherte Auswertung ermöglichen müssen. Dabei ist die Erforschung dynamischer Prozesse an lebenden Präparaten eine zentrale Herausforderung.

Grenzen
Trotz einer Verbesserung der Optiken in modernen Lichtmikroskopen werden aktuelle Messsysteme an die gleichen physikalischen Abbildungsgrenzen geführt, wie sie bereits 1873 von Ernst Abbe beschrieben wurden. Die Abbildungsgrenze wird durch die numerische Apertur des Objektivs und die Wellenlänge des verwendeten Lichts bestimmt. Mit kurzwelligem sichtbaren Licht lassen sich somit nur Strukturen auflösen, deren Ausdehnung lateral größer als 200 nm ist.

Bei der Betrachtung biologischer Strukturen sind allerdings besonders Objekte mit deutlich kleineren Abmessungen zum weiteren Verständnis der biologischen Abläufe von Interesse. Mit der Fluoreszenzmikroskopie wurde 1908 von August Köhler und Henry Siedentopf ein Ansatz zur gezielten optischen Anregung spezieller Moleküle entwickelt. In der Folge wurden spezialisierte fluoreszierende Stoffe zum Färben und Markieren einzelner Zellbestandteile entwickelt. Unter Verwendung einer kleinen Lochblende (Pinhole) patentierte Marvin Minsky 1957 das Prinzip der Konfokalmikroskopie. Hierdurch ist es möglich, gezielt Informationen nur aus der zu betrachtenden konjugierten Schärfeebene zu erhalten. Die Erzeugung eines Bilderstacks aus unterschiedlichen Schärfeebenen ermöglicht die Betrachtung 3-dimensionaler Bilder der Proben.

Schlüsselkomponenten
Mit der Herstellung des ersten Lasers von Theodore Maiman vor fast exakt 50 Jahren stand der Mikroskopie eine monochromatische und kohärente Lichtquelle zur Verfügung. Die entsprechenden Weiterentwicklungen im Bereich der Strahlquellen (Pulsdauer und Wellenlängen) ermöglichten in der Folge spektral sehr spezifische Anregungen der Fluoreszenz.

Fast zeitgleich wurde von Osamu Shimomura ein aus einer Qualle gewonnenes Protein beschrieben, welches durch eine kurzwellige Anregung (blau/ultraviolett) grünes Licht emittiert. Anfang der 90er wurde dieses Protein von Douglas Prasher kloniert und anschließend als Marker für andere Proteine verwendet [1]. Dieses Verfahren hat sich inzwischen zur Standardmethode in der Zellbiologie entwickelt.

Superauflösungsmikroskopie
Die Kombination der Strahlquellen, der Farbstoffe und der entsprechend empfindlichen Detektoren ermöglichte die Entwicklung der Superauflösungsmikroskopie. Die verfolgten Ansätze lassen sich in Abhängigkeit des betrachteten Lichtschnitts in Nahfeld- und Fernfeldmikroskopie unterscheiden. Ansätze aus der Nahfeldmikroskopie sind das TIRF Mikroskop (Total internal reflection fluorescence microscope) und das optische Rasternahfeldmikroskop (scanning nearfield optical microscope, SNOM/NSOM). Beide Systeme nutzen die geringe Beleuchtungstiefe des Objekts durch ein evaneszentes Feld und die damit verbundene Anregung der Fluoreszenz in unmittelbare Nähe (Nahfeld). Die erzielte hohe räumliche und zeitliche Auflösung kann hervorragend zur Untersuchung von Wechselwirkungsprozessen an Grenzflächen oder Zellmembranen eingesetzt werden.

Weiter entfernte Bereiche lassen sich mit der von Stefan Hell und seiner Arbeitsgruppe in Göttingen 1999 entwickelten STED Mikroskopie in einer Auflösung von wenigen nm betrachten [2]. Seit 2006 steht mit der Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beziehungsweise der Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) die Möglichkeit zur Betrachtung einzelner Moleküle zur Verfügung. Mittels 4PI und STED-Mikroskopie können räumlich sehr hoch aufgelöste Darstellungen von biologischen Proben erzeugt werden. Die STED-Mikroskopie liefert dabei lateral und die 4PI-STED-Mikroskopie lateral und axial räumlich hochaufgelöste Bilder unterhalb der Beugungsgrenze. Die zeitliche Auflösung ist vergleichbar mit der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie.

Kooperative Diskussion
In Deutschland sind aufgrund der Forschungsleistungen die beiden Mikroskopiehersteller Leica und Zeiss entstanden und ansässig. Auf Einladung des niedersächsischen Kompetenznetzes für Optische Technologien, dem PhotonicNet, finden sich seit 2002 in Kooperation mit Leica und Zeiss jährlich Wissenschaftler und Entwickler zusammen, um gemeinsam über aktuelle Mikroskopiekonzepte, sowie die Errungenschaften und Bedürfnisse der Anwender zu diskutieren. Unter dem Titel „Dynamik, Messbereich und Auflösung", wurden in Göttingen für das Jahr 2010 die unterschiedlichen Auflösungsbereiche moderner Mikroskope, deren erweiterte Funktionsweisen und Anwendungen betrachtet. Die Untersuchungsmöglichkeiten variierten von der Betrachtung lebender Zellen mit Auflösungen im Nanometerbereich bis zur Betrachtung von Werkstoffen. Es wurden neben der Ortsinformation auch die funktionellen Informationen betrachtet. Der Schwerpunkt lag einerseits bei der korrelativen Mikroskopie, bei der die Ergebnisse der Lichtmikroskopie mit denen der Elektronenmikroskopie zusammengeführt werden, andererseits wurden konfokale Höchstauflösungen durch Fluoreszenzmikroskope vorgestellt.

Dr. Roger Albert Wepf von der ETH Zürich und Volker Pusch von der Hochschule Aalen stellten neuste Ergebnisse der korrelativen Mikroskopie vor. Hierbei wurden Anwendungen in der Werkstoffforschung sowie die Betrachtung biologischer Proben gezeigt. Die Einsatzbereiche der konfokalen Höchstauflösung wurden für die Gebiete Biologie und Photophysik präsentiert. Dr. Werner Zuschratter vom Leibniz-Institut für Neurobiologie aus Magdeburg stellte den Einsatz einer 2-Kanal STED und Multiparameter-FLIM in der Neurobiologie vor. Die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie an optisch geklärtem Hirngewebe ermöglicht eine hohe Eindringtiefe. Hier zeigt Dr. Günter Giese vom MPI für Medizinische Forschung aus Heidelberg beeindruckende Bilder. Prof. Dr. Walter Neu von der Hochschule Emden/Leer stellte eine zeitaufgelöste 4D Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen vor. Hierfür wurden neue Ansätze zur Umsetzung der konfokalen Betrachtung erläutert.

Die Mikroskopieszene wird sich Ende des Jahres wieder in Wetzlar zusammenfinden, um gemeinsam die Technologietrends und Forschungsergebnisse aus 2011 zu diskutieren.

Fazit
Mit der Superauflösungsmikroskopie stehen den Forschern und Entwicklern neue hochauflösende Werkzeuge zur Verfügung. Die Anwendung solcher Systeme ist durch durchdachte Oberflächen sehr komfortabel geworden. Die Fragestellung „Was kann wie womit dargestellt werden" und die
Benennung der Anforderungen und weiterer Verbesserungen an die entspreche nden Mikroskope, können nur gemeinsam zwischen den Anwendern, Forschern und Mikroskopherstellern gelöst
werden.

Literatur
[1] Prasher D.C. et al.: Primary structure of the Aequorea Vicotria green-fluorescent protein, Gene 111: 229-33
[2] Hell S.W. und Wichmann J.: Breaking the diffraction limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy, Optics Letters 19: 780-2

Kontakt
Dr.-Ing. Thomas Fahlbusch
Geschäftsführer
PhotonicNet GmbH
Garbsener Landstraße 10
Hannover
www.photonicnet.de

Prof. Dr. Walter Neu
Hochschule Emden/Leer - University of Applied Sciences
Fachbereich Technik - Naturwissenschaftliche Technik 
Institut für Lasertechnik (ILO) - Lasermedizintechnik / Analytik und Spektroskopie
Emden
wn@fho-emden.de

 

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