Biomimetische Sensoren: Anwendungen von Kernrezeptoren im Pharma-Screening

  • Abb. 1: Prinzip des TIRF basierten TestsAbb. 1: Prinzip des TIRF basierten Tests
  • Abb. 1: Prinzip des TIRF basierten Tests
  • Abb. 2: Kalibrierung des Sensors mit den natürlichen Estrogenen Estradiol und Estron. Die unterschiedlichen Affinitäten spiegeln sich durch die Verschiebung des Testmittelpunkts wider
  • Abb. 3: Ligandenbindungsdomäne des ERs mit unterschiedlichen Liganden. Je nach Wirkungsweise ändert sich die Konformation und es werden unterschiedliche Bindungssignale erhalten.
  • Abb. 4: Prinzip von RIfS: Durch Mehrfachreflexion an dünnen Grenzschichten wird ein Interferenzspektrum erhalten. Die Verschiebung des Interferenzspektrums bei Anlagerung von Molekülen wird genutzt, um Bindungsvorgänge zeitaufgelöst und markierungsfrei zu verfolgen.
  • (v.l.n.r.) Peter Fechner, Alexander Le Blanc, Prof. Dr. Günter Gauglitz

Biomimetische Sensoren, die körpereigene Zielstrukturen von Wirkstoffen nutzen, erlauben schnelle, kostengünstige und verlässliche Aussagen über die Affinität und somit die wirksame Konzentrationen eines Wirkstoffes. Neuere Testverfahren simulieren hingegen spätere Schritte der Signaltransduktion und spiegeln somit den Wirkmechanismus einer Substanz wider. Damit lässt sich der Effekt einer Substanz auf das zu beeinflussende System abschätzen. Am Beispiel des Estrogenrezeptors werden zwei derartige Verfahren vorgestellt.

Einleitung

Der Estrogenrezeptor α (ERα) ist ein Transkriptionsfaktor, der als Antwort auf Estrogene die Expression bestimmter Gene modulieren kann. ERα spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen Erkrankungen wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose und Erkrankungen des kardiovaskulären Systems sowie des zentralen Nervensystems. Somit spielen Agonisten und Antagonisten des Rezeptors, also Moleküle, die den Rezeptor an- oder ausschalten, eine wichtige Rolle in diversen Therapien.

Das Screening nach neuen, selektiveren Wirkstoffen stellt eine große Herausforderung für die Pharmaindustrie dar. Um den Einsatz von ERα in biomimetischen Sensoren zu verstehen, ist die Kenntnis über bestimmte Schlüsselfunktionen des Rezeptors wichtig. ERα verfügt über eine Ligandenbindungsdomäne (LBD), die selektiv das Hormonsignal erkennt und daraufhin eine Konformationsänderung im Rezeptor induziert. Der Rezeptor ist dann in der Lage an andere Proteine zu binden, woraufhin er in den Zellkern transportiert wird und an bestimmte DNA Sequenzen bindet.

Dies führt zur Modulation der Expression verschiedener Gene. In diesem Übersichtsartikel werden zwei Testverfahren vorgestellt, die auf optischen Transduktionsprinzipien beruhen und die LBD als Erkennungsstruktur nutzen. Das erste eignet sich vor allem für das Screening nach neuen Wirkstoffen im Hochdurchsatz, das zweite simuliert die folgenden Schritte in der Signalkaskade und kann damit zu einer zielgerichteten Entwicklung selektiverer Wirkstoffe mit geringeren Nebenwirkungen führen.

Verfahren zum Screening neuer Wirkstoffe

Für das Verfahren zum Screening neuer Wirkstoffe werden fluoreszenzmarkierte ERα-LBDs mit dem Wirkstoff vorinkubiert und anschließend über den mit Estrogen beschichteten Sensorchip geleitet.

Mittels Totaler Interner Reflexions-Fluoreszenz (TIRF) [1] wird die Bindung detektiert. Rezeptoren können nur im Fall einer freien Bindungstasche an die Oberfläche binden. Desweiteren werden nur oberflächengebundene Fluorophore zur Fluoreszenz angeregt. Das erhaltene Signal wird also durch steigende Estrogen-Konzentrationen immer stärker abgeschwächt.

Abbildung 1 stellt diesen Zusammenhang schematisch dar. Dieses Testverfahren wurde ursprünglich für die Analytik von Flusswasser etabliert [2]. Der besondere Vorteil liegt darin, dass sowohl bekannte als auch unbekannte, estrogenartige Substanzen detektiert werden können, für einige Substanzen sogar bis deutlich in den subnanomolaren Bereich. Weiterhin kann das System die Summe der Wirkungen aller enthaltenen Substanzen abschätzen und spiegelt somit die potentielle Beeinflussung des Hormonsystems wider.

Durch die Tatsache, dass mit sehr niedrigen Rezeptorkonzentrationen gearbeitet werden kann, eignet sich das Verfahren auch zur Bestimmung von Affinitätskonstanten. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, spiegelt sich die unterschiedliche Affinität der beiden natürlichen Estrogene Estradiol und Estron in einer Verschiebung des Testmittelpunkts wider. Die Rezeptormoleküle werden durch das speziell entwickelte Markierungsverfahren kaum in ihrer Affinität beeinflusst. Die automatisierte Probenhandhabung durch einen HTS PAL Autosampler garantiert neben einem geringen Arbeitsaufwand auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Somit ist das Verfahren bestens geeignet, um neue Substanzen auf ihre Affinität hin zu testen. In frühen Phasen der Entwicklung können somit aufwendigere Zellkulturtests umgangen werden.Der größte Nachteil dieses Verfahrens liegt in der Tatsache, dass nicht zwischen Agonisten und Antagonisten unterschieden werden kann. Daher wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, mit dem die folgenden Schritte der Signalkaskade nachgebildet wurden.

Verfahren zur Bestimmung des Wirkmechanismus

Der Effekt von Wirkstoffen auf den ER hängt nicht nur davon ab, ob der Wirkstoff an den ER bindet, sondern auch davon, was danach mit dem Rezeptor geschieht. Handelt es sich um einen Wirkstoff mit aktivierender Wirkung (Agonist), bewirkt dieser im ER eine Konformationsänderung, die letztendlich zu einer Antwort der Zelle auf den Wirkstoff führt.

Handelt es sich jedoch um einen Wirkstoff mit desaktivierender Wirkung (Antagonist), so blockiert dieser Wirkstoff die Bindetasche für andere Wirkstoffe, verhindert aber gleichzeitig eine Konformationsänderung des ERs (s. Abb. 3). Als Folge wird die Zelle keine Antwort auf diesen Wirkstoff aussenden. Diese Antagonisten sind von großer Bedeutung, wenn es darum geht, den Estrogensignalweg in Zellen „abzustellen“. Als klassisches Beispiel ist hier die Behandlung von Brustkrebs zu nennen, wobei das Wachstum von Tumoren durch die Gabe dieser antagonistischen Wirkstoffe gehemmt wird.

Obwohl Biosensoren eigentlich nicht dafür geeignet sind, solch kleine Konformationsänderungen zu unterscheiden, gibt es eine elegante Möglichkeit dies zu bewerkstelligen. Unter Verwendung der reflektometrischen Interferenzspektroskopie konnte ein markierungsfreier Assay entwickelt werden, der schnell, präzise und mit minimalem Materialaufwand zwischen den zwei Konformationen des ERs und somit zwischen Agonist oder Antagonist unterscheiden kann [3].

Das Messprinzip ist in Abbildung 4 dargestellt. Hierzu bedient man sich kurzer Peptide, die unterschiedliche Affinitäten zu den verschiedenen Konformationen des Estrogenrezeptors aufweisen. Diese Peptide können immobilisiert werden und ermöglichen die Bindung des ERs, abhängig davon, ob dieser mit einem Wirkstoff aktiviert oder desaktiviert wurde.

Zusammenfassung

Durch Simulation physiologischer Vorgänge in Biosensoranwendungen lassen sich in einem relativ simplen Testformat quantitative und qualitative Informationen erhalten, für die sonst deutlich aufwändigere Verfahren wie Zellkulturtests nötig sind. Die gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sowie die Möglichkeit des Hochdurchsatz- Screenings machen diese Methoden interessant in frühen Schritten der Wirkstoffentwicklung.

Markierungsfreie Testsysteme zeichnen sich dabei durch besonders hohe Flexibilität, geringen Materialaufwand und geringe Beeinflussung der Zielstruktur aus. Bei fluoreszenzbasierten Systemen hingegen wurde die Markierung für eine besonders effiziente Detektion designt, wodurch diese Tests durch besonders niedrige Nachweisgrenzen punkten und sich als robust gegenüber Matrixeffekten herausgestellt haben.

Je nach Fragestellung lassen sich die Anwendungen flexibel anpassen. Fragment basiertes Screening lässt sich ebenso realisieren wie die Untersuchung von peptidbasierten Wirkstoffen. Die Sensorbeschichtung nach dem Baukastenprinzip ermöglicht außerdem die einfache Anpassung an andere Zielstrukturen als den ER.

Literatur

[1] Barzen C. et al.: Biosens Bioelectron 17(4):289–295 (2002)

[2] Le Blanc A.F. et al.: Anal Bioanal Chem 395(6):1769–1776 (2009)

[3] Fechner P. et al.: Anal Bioanal Chem 393(6-7), 1579–1585 (2009)

Kontakt

Dipl. Biochem. Alexander Fabian Le Blanc

Institut für Physikalische und Theoretische Chemie (IPTC)

Eberhard Karls Universität Tübingen

http://barolo.ipc.uni-tuebingen.de

 

Dr. Peter Fechner Biametrics GmbH

Tübingen

http://biametrics.com

 

Autor(en)

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Telefon: +49 7071 29 76927
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