Cannabinoid-Rezeptoren

Präzise Kontrolle mittels THC-Photoswitches

  • Computergestütztes Andocken von azo-THC 1 und 2 in die Kristallstruktur von CB1 veranschaulicht deren komplementäres Verhalten bezüglich cis- und trans-Aktivität. Abbildung adaptiert mit Erlaubnis aus Westphal, M. V. et al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 18206. Copyright (2017) American Chemical Society [1]Computergestütztes Andocken von azo-THC 1 und 2 in die Kristallstruktur von CB1 veranschaulicht deren komplementäres Verhalten bezüglich cis- und trans-Aktivität. Abbildung adaptiert mit Erlaubnis aus Westphal, M. V. et al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 18206. Copyright (2017) American Chemical Society [1]
  • Computergestütztes Andocken von azo-THC 1 und 2 in die Kristallstruktur von CB1 veranschaulicht deren komplementäres Verhalten bezüglich cis- und trans-Aktivität. Abbildung adaptiert mit Erlaubnis aus Westphal, M. V. et al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 18206. Copyright (2017) American Chemical Society [1]
  • Abb. 1 : Photoswitching zwischen trans- und cis-azo-THC 1 ermöglicht reversible optische Kontrolle über die Aktivität des CB1 Rezeptors. Abbildung adaptiert mit Erlaubnis aus Westphal, M. V. et al. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 18206. Copyright (2017) American Chemical Society [1]

Tetrahydrocannabinol (THC) ist aktuell in aller Munde; als Wundermittel für Verfechter der vielfältigen Cannabis-Therapien und als Reizwort für Cannabis-Legalisierungsgegner. Durch den erfolgreichen Einsatz von THC-Präparaten für die Linderung verschiedener Gebrechen und Krankheiten, sowie das sich verändernde politische Klima, scheint eine flächendeckende Legalisierung in Europa und Amerika, zumindest für medizinische Zwecke, nur eine Frage der Zeit zu sein.

Ein wissenschaftlich solides Verständnis für den molekularen Wirkungsmechanismus von THC im menschlichen Körper ist von zentraler Wichtigkeit für das Abschätzen von Chancen und Gefahren von medizinalen Cannabis-Produkten und kann als Basis für die politische Entscheidungsfindung dienen.

Das Endocannabinoidsystem

Die Identifikation von THC als psychoaktive Komponente in Cannabis Sativa in der Mitte des 20. Jahrhunderts führte zur Entdeckung der Cannabinoid-Rezeptoren 1 und 2 (CB1 und CB2), welche zusammen das Herzstück des Endocannabinoidsystemes bilden, eines der wichtigsten Signalübermittlungssysteme in allen Säugern inklusive des Menschen. So ist CB1 der meistexprimierte G Protein-gekoppelte Rezeptor im zentralen Nervensytem und ist entscheidend an der Regulation von Koordination, Stimmung und Bewusstsein beteiligt [2]. Der zweite Cannabinoid-Rezeptor, CB2, befindet sich hauptsächlich auf Immunzellen und Aktivierung desselben trägt immenses therapeutisches Potential für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Krebs. [3,4]. Das grosse Interesse der pharmazeutischen Industrie, die Cannabinoidrezeptoren für medizinische Zwecke zu modulieren, erstaunt daher nicht.

Das Verständnis für die Veränderungen der zellulären Prozesse, wenn endo- oder exogene Liganden an die Cannabinoidrezeptoren 1 und 2 binden und in der Folge (de-)aktivieren ist allerdings bis jetzt nur rudimentär vorhanden. Eine besondere Herausforderung stellt dabei die hohe Lypophilie der meisten Cannabinoid-Liganden dar, welche sich in die Zellmembranen einlagern und so das präzise Studium der Dynamik von Rezeptor-Aktivierung und Deaktivierung erschweren. Ein interessanter Lösungsansatz für diese Problematik bietet die Photopharmakologie.

Diese beruht auf dem Prinzip der reversiblen Umwandlung zwischen zwei Isomeren eines Ligand-Moleküles, welche idealerweise am studierten biologischen Ziel eine möglichst unterschiedliche Aktivität aufweisen. Licht als Stimulus ermöglicht so spatiotemporal präzise und reversible Kontrolle über die Aktivität des zu studierenden Rezeptors oder Enzymes.

Kontrolle über CB1 Aktivität 

Ausgangspunkt für unsere Bestrebungen, den Cannabinoid-Rezeptor 1 mit Licht zu kontrollieren, war der natürliche Hauptwirkstoff aus Cannabis, Δ9-THC, ein bekannter partieller CB1 Agonist. Wir konnten dabei auf unserer Expertise in der stereodivergenten Synthese von THC aufbauen [5]. Die Herausforderung bestand darin, die Aktivität von THC-Derivaten mittels Licht zu modulieren. Azobenzole sind das am weitesten verbreitete Chromophor in der Photopharmakologie, da sie relativ simpel in der Herstellung sind und sich die beiden Isomeren (E und Z) sowohl sterisch als auch elektronisch (Dipolmoment) stark voneinander unterscheiden. Diese Faktoren können, wenn richtig eingesetzt, zu unterschiedlichen Wirkungsprofilen der Ligand-Isomeren führen. Aus diesem Grund wurden mithilfe der oben genannten Synthese verschiedene Azobenzole an den THC-Kern gekoppelt. Diese synthetischen, lichtresponsiven THC-Derivate, oder azo-THCs, wurden dann in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern in verschiedenen zellbasierten Assays evaluiert.

Dr. James Frank und Prof. Dirk Trauner von der LMU München nutzten patch-clamp Elektrophysiologie um die Aktivität von CB1 auf Maustumorzellen (AtT-20(CB1)-Zellen) zu messen. Diese Zellen wurden mit GIRK (G protein-coupled inwardly rectifying potassium channels) transfiziert, einem Kaliumionenkanal, welcher über die -Untereinheit des heterotrimeren G Proteins an CB1 gekoppelt ist. Wird CB1 durch Binden eines Agonisten wie THC aktiviert, führt dies zur Öffnung von GIRK, und Kaliumionen fliessen aus der Zelle. Dieser resultierende elektrische Strom kann mittels Elektroden gemessen werden. Das erste vielversprechende Resultat wurde mit trans-azo-THC 1 beobachtet, welches in den Zellen einen kleinen Strom induzierte. Dieser Effekt konnte durch Isomerisierung zur cis-Form mittels ultraviolettem Licht (360 nm) potentiert werden, ein grösserer Strom wurde gemessen und blaues Licht (450 nm) stellte den ursprünglichen, kleineren Strom wieder her. Durch abwechselndes Beleuchten mit Licht der beiden Wellenlängen konnte diese Beobachtung über viele Zyklen wiederholt werden (Abb. 1).

Der potente Cannabinoid-Rezeptor-Antagonist Rimonabant negierte zudem jeglichen Effekt von trans- und cis-azo-THC 1. Die gemessenen Ströme kamen also wirklich aufgrund Aktivierung von CB1 und nicht durch direkte Wechselwirkung von azo-THC 1 mit GIRK zustande. Mit diesen Resultaten konnte die erfolgreiche optische Kontrolle der CB1-Aktivität mittels azo-THCs gezeigt werden. Zusätzlich konnte ein weiteres, vielversprechendes TCH-Derivat, azo-THC 2, identifiziert werden. Dieses war im Gegensatz zu azo-THC 1 in der thermodynamisch stabileren trans-Form aktiver und der gemessene Strom wurde durch Isomerisierung zur cis-Form kleiner.

Die CB1-GIRK Kopplung ist nur eine Möglichkeit unter vielen, um die optische Kontrolle über CB1 zu evaluieren. So konnten Dr. Amey Dhopeshwarkar und Prof. Ken Mackie von der University of Indiana die zelluläre cAMP-Levels mittels azo-THCs steuern. CB1 ist via -Untereinheit negativ an Adenylyl Cyclase gekoppelt, Aktivierung von CB1 reduziert die cAMP Konzentration. Auch in diesem Assay zeigt sich azo-THC 1 aktiver in der cis-form, azo-THC 2 aktiver in der trans-form. Das komplementäre Verhalten von azo-THC 1 und 2 konnte mittels computer-basierten Studien, durchgeführt von Dr. Jessica Grandner und Prof. Vsevolod Katritch von der University of Southern California, rationalisiert werden. In diesen Berechnungen zeigte sich, dass nur cis-azo-THC 1 und trans-azo-THC 2 mit hoher Affinität an eine kürzlich publizierte Kristallstruktur von CB1 binden (Aufmacherbild 2). Die anderen Isomere dieser azo-THC-Derivate wiesen ungünstige Wechselwirkungen mit dem Rezeptor auf, was deren Bindung an den Rezeptor verhindert.

Fazit und Ausblick

Mit azo-THC 1 und 2 stehen die ersten Werkzeuge zum Studium von Cannabinoid-Rezeptor Signalwegen zu Verfügung, welche reversible optische Kontrolle über die Aktivität des CB1-Rezeptors ermöglichen. Durch ihr komplementäres Verhalten sind die beiden azo-THCs flexibel anwendbar, je nachdem ob im Experiment höhere Aktivität in der thermodynamisch stabileren trans-Form oder erst nach Photoisomerisierung erwünscht ist. Indes bieten azo-THC 1 und 2 noch Verbesserungspotential, da sie CB1 nicht in einer Ein/Aus-Weise kontrollieren, sondern auch in der weniger aktiven Form eine basale Aktivität aufweisen. Die Vergrösserung dieser Aktivitätsdifferenz zwischen den cis- und trans-Formen wird derzeit genauso angestrebt wie die Entwicklung von Derivaten, welche Isomerisierung durch rotes Licht ermöglichen. Rotes Licht dringt, im Vergleich zu ultraviolettem oder blauem Licht, tiefer in Gewebe ein und eignet sich daher besser für photopharmakologische Versuche in diesen oder für in-vivo Experimente. Zudem wird eine Ausweitung des photopharmakologischen Ansatzes auf den therapeutisch hochrelevanten CB2-Rezeptor angestrebt.

Die bestehenden und zukünftigen azo-THCs bieten eine neuartige Möglichkeit, unser Verständnis von CB1 kontrollierten Signalkaskaden in unterschiedlichen Zelltypen entscheidend zu vertiefen. Ultimativ könnten diese erweiterten Kenntnisse über die Dynamik der CB1- und CB2-Aktivierung und Deaktivierung entscheidend zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie zum Beispiel Alzheimer und Multiple Sklerose, sowie von Krebs beitragen.

Autoren
Roman C. Sarott1 und Erick M. Carreira1

Zugehörigkeiten
1Departement Chemie und Angewandte Biowissenschaften, Laboratorium für Organische Chemie, ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Kontakt  
Prof. Erick M. Carreira

ETH Zürich
Laboratorium für Organische Chemie
Zürich, Schweiz

Referenzen

[1] Westphal, M. V.; Schafroth, M. A.; Sarott, R. C.; Imhof, M. A.; Bold, C. P.; Leippe, P.; Dhopeshwarkar, A.; Grandner, J.; Katritch, V.; Mackie, K.; Trauner, D.; Carreira, E. M.; Frank, J.; "Synthesis of Photoswitchable Δ9-Tetrahydrocannabinol Derivatives Enables Optical Control of Cannabinoid Receptor 1 Signaling" A. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 18206. DOI:10.1021/jacs.7b06456

[2] Svíženská, I.; Dubový, P.; Šulcová, A. Pharmacol.; "Cannabinoid receptors 1 and 2 (CB1 and CB2), their distribution, ligands and functional involvement in nervous system structures" Biochem. Behav. 2008, 90, 501. DOI:10.1016/j.pbb.2008.05.010

[3] Ranieri R.; Laezza C.; Bifulco M.; Marasco D.; Malfitano AM; "Endocannabinoid System in Neurological Disorders" Recent Pat CNS Drug Discov. 2016, 10, 90. DOI:10.2174/1574889810999160719105433

[4] Marino S.; Idris AI.; "Emerging therapeutic targets in cancer induced bone disease: A focus on the peripheral type 2 cannabinoid receptor" Pharmacol Res. 2017 119, 391. DOI:10.1016/j.phrs.2017.02.023

[5] Schafroth, M. A.; Zuccarello, G.; Krautwald, S.; Sarlah, D.; Carreira, E. M.; "Stereodivergent Total Synthesis of Δ9-Tetrahydrocannabinols" Angew. Chem., Int. Ed. 2014, 53, 13898. DOI:10.1002/anie.201408380Roman C.

Übersichtsartikel Endocannabinole

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