Der Detektor

Universell oder selektiv?

  • Abb. 1: Optimierter Systemaufbau bei Kopplung eines Mikro-LC-Systems mit dem Massenspektrometer.Abb. 1: Optimierter Systemaufbau bei Kopplung eines Mikro-LC-Systems mit dem Massenspektrometer.
  • Abb. 1: Optimierter Systemaufbau bei Kopplung eines Mikro-LC-Systems mit dem Massenspektrometer.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der Kopplung einer flexibel positionierbaren UV-Zelle mit einem Massenspektrometer.
  • Abb. 3: Vergleich der Peakkapazität (np) bei Verwendung eines systemintegrierten Mikro-LC UV-Detektors (schwarze Kurve) sowie einer UV-Zelle auf Basis der Lichtleitertechnologie (rote Kurve). Die Daten wurden für Gradientenzeiten (tG) von 0,15 bis 0,5 Minuten unter Verwendung einer mit sub-2 µm Partikeln gepackten Säule ermittelt.
  • Abb. 4: Trennung von Steroiden mittels Verdampfungslichtstreu-Detektion. Rote Spur: konventioneller ELSD; schwarze Spur: Mikro-LC Lichtstreudetektor. Chromatografische Bedingungen: Flussrate: 45 µL min-1; Mobile Phase: (A) Wasser, (B) Methanol; Lösemittelgradient: siehe Abbildung; Stationäre Phase: Kinetex (Phenomenex) C18 300 μm x 50 mm, 2,6 μm; Injektionsvolumen: 0,15 µL; Temperatur: 60°C; Analyten: 1: Estriol; 2: 1,4-Androstadiene-3,17-dion; 3: Boldenon; 4: β-Estradiol; 5: Testosteron; 6: Trans-dehydroandrosteron; 7: Epitestosteron; 8: Etiocholane-3α-ol-17-on.

In den letzten Jahren halten massenspektrometrische Detektoren vermehrt Einzug in analytische Laboratorien. Zwar ist der UV-Detektor immer noch „der“ Standard-Detektor der HPLC, jedoch ist abzusehen, dass dieser von einfachen Massenspektrometern (MS) in naher Zukunft abgelöst werden wird. Warum die Kopplung zwischen Mikro-LC und MS geradezu ideal ist, möchten wir nachfolgend erläutern.

Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ist die am häufigsten verwendete Ionisierungstechnik für die Kopplung zwischen HPLC und MS. Die Schnittstelle zwischen der HPLC und dem Massenspektrometer hat hierbei die Aufgabe, die flüssige mobile Phase zu verdampfen und Analytionen in der Gasphase zu erzeugen. Aus einem relativ kleinen Flüssigkeitsvolumen entsteht somit bei der Verdampfung ein großes Gasvolumen, das vor dem Einlass in das Hochvakuum des Massenspektrometers abgeführt werden muss. Es liegt daher auf der Hand, dass die Miniaturisierung der HPLC und damit einhergehend auch die Reduzierung der absoluten Flussrate auf wenige Mikroliter in der Minute einen deutlichen Vorteil in Bezug auf die HPLC-MS-Kopplung darstellt.

Systemvolumina

Um die Güte der Trennung zu erhalten ist es notwendig, alle Systemvolumina außerhalb der Säule, die zu einem signifikanten Verlust der Trenneffizienz beitragen, zu minimieren. Wie wir bereits im Beitrag „Mikro-LC Grundlagen“ erläutert haben, sollten alle Verbindungskapillaren zwischen dem Injektor und der Säule sowie zwischen der Säule und dem Detektor ein möglichst kleines Volumen aufweisen. Dies bedeutet, sowohl die Länge, als auch den Innendurchmesser (ID) der Kapillaren anzupassen. Für Mikro-LC-Säulen mit einem ID von 300 µm sollte der ID der Verbindungskapillaren 50 µm betragen, wie wir im Beitrag GIT&T (Kapillaren) anschaulich dargestellt haben. Die Positionierung des HPLC-Systems zum Massenspektrometer sollte so erfolgen, dass möglichst kurze Wege entstehen. Eine Konfiguration, bei der das Mikro-LC-System auf dem MS aufgebaut ist, zeigt Abbildung 1. Der frei im Raum positionierbare Säulenofen kann dabei die Weglänge zwischen dem Injektor und der Säule sowie zwischen dem Auslass der Säule und dem Einlass in die Ionenquelle deutlich reduzieren.

Emittertip

Des Weiteren ist es notwendig, den Innendurchmesser des Emittertips anzupassen.

Ist der ID des Emittertips deutlich größer als 50 µm, kommt es zu einem Verlust an Trennleistung und somit zur Koelution der in der Säule getrennten Banden. In vielen Fällen hat der Anwender keine Möglichkeit, das Emittertip auszutauschen. Einige Gerätehersteller bieten aber die Möglichkeit, Emittertips mit unterschiedlichem ID einzusetzen, sodass bei der Mikro-LC-MS-Kopplung nahezu kein Verlust der intrinsischen, d. h. der Trennsäule innewohnenden, Trennleistung zu beobachten ist. Ein Wechsel des Emittertips lässt sich bei manchen Geräte innerhalb weniger Minuten durchführen und bedeutet für den Anwender nahezu keinen Aufwand. Weitere Modifikationen am Massenspektrometer sind in diesem speziellen Fall nicht notwendig, d. h. die Standard-ESI-Quelle kann sowohl für „High-Flow“- als auch für „Low-Flow“-Anwendungen genutzt werden. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber speziellen Nano-ESI-Quellen. Hierbei ist ein teilweise beträchtlicher Aufwand in der exakten Ausrichtung und Positionierung des Emittertips notwendig, um eine gute Spraystabilität und dementsprechend hohe Ionisierungseffizienz zu erzielen.

Andere Detektoren

Neben der Massenspektrometrie spielen natürlich auch weitere Detektionstechniken, wie die UV-, Fluoreszenz- oder Lichtstreudetektion, immer noch eine große Rolle, sodass die Verfügbarkeit solcher HPLC-Detektoren im miniaturisierten Format ein weiteres notwendiges Kriterium darstellt, um die Mikro-LC möglichst umfassend in allen relevanten Applikationsfeldern einsetzen zu können. Auch wenn es eine Vielzahl unterschiedlicher UV-Detektoren gibt, die für die Mikro- oder sogar Nano-LC geeignet sind, werden häufig relativ lange Transferkapillaren benötigt, um die Säule mit dem Detektor zu verbinden. Dies liegt an der modularen Bauweise von HPLC-Systemen, die wie eine traditionelle „Hi-Fi“-Anlage aufgebaut sind. Eine elegante Möglichkeit, das Außer-Säulen-Volumen zu reduzieren, ist die Positionierung der Detektionszelle unmittelbar hinter der Trennsäule und deren optische Ankopplung über Lichtwellenleiter. Dies ist besonders vorteilhaft, weil die UV-Zelle direkt zwischen der Trennsäule und der Ionenquelle des Massenspektrometers integriert werden kann, wie dies schematisch in Abbildung 2 dargestellt ist.

UV-Detektoren mit einer ausgekoppelten Detektionszelle für die Mikro- und Nano-LC auf Basis der Lichtleitertechnologie sind kommerziell verfügbar. Hetzel et al. haben in einer Studie demonstriert, dass gegenüber einem „Standard-Mikro-LC-UV-Detektor“ mit einer neu entwickelten Detektionszelle (Knauer) eine signifikant höhere Peakkapazität erhalten wird. Die schwarze Kurve in Abbildung 3 repräsentiert die Peakkapazität in Abhängigkeit der Gradientenzeit, wenn der Standard-UV-Detektor des Mikro-LC-Systems verwendet wird, wohingegen die rote Kurve erhalten wird, wenn der Standard UV-Detektor durch die genannte UV-Zelle ausgetauscht wird. Für eine Gradientenzeit von 0,5 Minuten beträgt die Differenz der Peakkapazitäten 30%, wenn eine mit sub 2 µm Partikeln gefüllte Säule verwendet wird. Dieses Beispiel belegt eindrucksvoll, dass bereits kleine Außer-Säulen-Volumina einen großen Einfluss auf die Trennleistung des Gesamtsystems haben.

ESLD

Noch eindrucksvoller wird der Unterschied, wenn ein konventioneller und ein für die Mikro-LC entwickelter ELSD (Evaporative Light Scattering Detector, Verdampfungslichtstreu-Detektor) miteinander verglichen werden. Solche Detektoren kommen immer dann zum Einsatz, wenn die Analyten kein Chromophor besitzen und nicht oder nur schlecht mit UV-Detektion erfasst werden können. In der Abbildung 4 sind zwei Chromatogramme dargestellt. Die rote Spur resultiert, wenn ein für die konventionelle HPLC geeigneter Lichtstreudetektor verwendet wird. Die schwarze Spur wird erhalten, wenn ein speziell für die Mikro-LC modifizierter Lichtstreudetektor (Sedere) verwendet wird. Es ist deutlich zu erkennen, dass das Systemvolumen des konventionellen ELSD viel zu groß ist, sodass kein Signal erhalten wird.

Fazit

Auch wenn die Verfügbarkeit von miniaturisierten Detektoren, die mit der Mikro-LC kompatibel sind, noch eingeschränkt ist, gibt es für nahezu jedes Detektionsverfahren eine entsprechende Systemlösung für die Mikro-LC. Die Mikro-HPLC-MS-Kopplung lässt sich dabei auf sehr einfache Weise realisieren, wenn das Emittertip des Massenspektrometers austauschbar und dessen ID frei wählbar ist. Aktuelle Entwicklungen aus dem Bereich der UHPLC haben es erforderlich gemacht, ESI-Quellen auch für höhere Flussraten bis 1 mL min-1 auszulegen. Dies wiederum ist ein Trend, der der Mikro-LC-Kopplung entgegensteht. Es bleibt nun abzuwarten, ob die MS Gerätehersteller weiterhin das Ziel verfolgen, die konventionellen ESI-Quellen für höhere Flussraten auszulegen oder ob an dieser Stelle ein Umdenken stattfindet.

Autoren
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel2, Juri Leonhardt1

Zugehörigkeiten
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., IUTA, Duisburg, Deutschland
2Bayer AG, Wuppertal, Deutschland

Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg

Institut für Energie- und
Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
& Miniaturisierung
Duisburg, Deutschland
teutenberg@iuta.de

Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

Möchten Sie mehr zum Thema Mikro-LC lernen? Schauen Sie sich das Projekt "Fortschrittliche Chromatographie" an.

Grundlagen der Mikro-LC finden Sie kompakt in der Chemgapedia Lerneinheit Mikro-LC.

Grundlagen der 2D-LC finden Sie in der Chemgapedia Lerneinheit 2D-LC

 

 

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