Die Nano-Bio-Grenzfläche

Analyse der Proteinkorona als Schlüssel für die biomedizinische Anwendung von Nanocarriern

  • Abb. 1: Die chemische und biologische  Identität von Nanomaterialien für den gezielten Wirkstofftransport. Abb. 1: Die chemische und biologische Identität von Nanomaterialien für den gezielten Wirkstofftransport.
  • Abb. 1: Die chemische und biologische  Identität von Nanomaterialien für den gezielten Wirkstofftransport.
  • Abb. 2: Zusammensetzung und analytische Methoden zur Charakterisierung der Proteinkorona.
  • Abb. 3: Einfluss der Proteinkorona auf den Stealth-Effekt [3] und das gezielte Targeting [4].  Copyright @ Springer Nature. Erlaubnis von Nature Nanotechnology.

Die therapeutische Effizienz von intravenös applizierten Medikamenten (z. B. Zytostatika) ist vor allem durch die systemische Verteilung im gesamten Körper limitiert. In vielen Fällen erreicht weniger als 1 % des Medikaments die Zielstelle, wodurch erhebliche Nebenwirkungen hervorgerufen werden können. Im Vergleich zu den derzeitigen therapeutischen Ansätzen (z. B. zur Krebsbehandlung) bietet die Nanomedizin viele Vorteile. Die Verkapselung von Medikamenten in Nanotransportern soll eine gezielte Wirkstofffreisetzung in der gewünschten Körperregion ermöglichen. In den letzten 20 Jahren wurden eine Vielzahl von solchen Nanoträgern entwickelt. Damit diese eine klinische Anwendung finden können, muss deren Verhalten in einem physiologischen Medium wie Blut charakterisiert werden.

Vom synthetischen Design zum biologischen Verhalten

Für eine erfolgreiche biomedizinische Anwendung eines Nanocarriers für den Wirkstofftransport muss dieser mehrere Kriterien erfüllen. Ein ideales Trägersystem soll das verkapselte Medikament in einer hohen Konzentration zur Zielzelle transportieren. Dadurch bleibt das gesunde Gewebe unbeeinträchtigt und das verkapselte Medikament wird vor dem Abbau geschützt. Sobald die Zielzelle erreicht wird, muss das Medikament spezifisch freigesetzt werden. Üblicherweise ist die Oberfläche der Nanocarrier mit hydrophilen Polymeren (z. B. Poly (ethylenglycol), PEG) funktionalisiert, wodurch die Proteinadsorption reduziert werden soll und die unspezifische Zellaufnahme in Phagozyten verhindert wird. Weiterhin, soll dies zu einer verlängerten Blutzirkulationszeit der Nanocarrier führen („Stealth-Eigenschaften“). Darüber hinaus werden Liganden (z.B. Antikörper) an die Oberfläche der Nanoträger gebracht, um eine spezifische Zellerkennung zu ermöglichen.

Der exponentielle Anstieg von Veröffentlichungen (PubMed) zwischen 1995 (83) und 2017 (19 628) zum Thema „Nanoparticle“ unterstreicht deren stark wachsendes wissenschaftliches Interesse. Bisher gibt es jedoch nur sehr wenige Nanomaterialien, die tatsächlich eine klinische Anwendung gefunden haben (2017: 53 FDA zugelassene Systeme).

Dies bedeutet, dass eine große Lücke zwischen der Entwicklung neuer Nanoträger und deren therapeutischen Potenzial besteht.

Während des letzten Jahrzehnts wurde erkannt, dass nach unmittelbarem Kontakt des Nanocarriers mit Blut an dessen Oberfläche verschiedene Biomoleküle (z. B. Proteine, Lipide) adsorbieren. Es entsteht eine „Biomolekül-/Proteinkorona“.

„What the cell sees“ ist also nicht die Oberfläche des nackten Trägers, sondern dessen umgebende Proteinschicht [1]. Um das Verhalten der Nanoträger im Blut zu verstehen, ist somit die Charakterisierung der adsorbierten Proteinschicht von essentieller Bedeutung (Abb. 1). Dieses Wissen wird benötigt, um eine nächste Generation von Nanocarriern mit maßgeschneiderten biologischen Eigenschaften und dadurch einer verbesserten therapeutischen Effizienz zu entwickeln.

Analytische Methoden zur Charakterisierung von Nanopartikel- Protein-Interaktionen

Im Allgemeinen wird die Proteinkorona in zwei verschiedene Schichten unterteilt, die als „weiche“ und „harte“ Proteinkorona bezeichnet werden [2]. Diese unterscheiden sich durch die Bindungsaffinität der Proteine an die Oberfläche der Nanoträger (Abb. 2). Die harte Korona besteht aus Proteinen, die vergleichsweise fest gebunden sind und eine geringe Austauschrate haben. Im Gegensatz dazu umfasst die weiche Korona lose gebundene Proteine, die leicht von der Oberfläche der Nanoträger desorbieren. Da die weiche Korona sehr dynamisch ist, sind analytische Methoden erforderlich, die Kenntnisse über die direkten Wechselwirkungen von Nanoträgern innerhalb einer Proteinquelle liefern.
Mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS) wird der hydrodynamische Radius von Nanoträgern vor und nach der Inkubation mit Proteinen über deren Diffusionskoeffizienten mittels Stokes-Einstein-Beziehung bestimmt. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist ein komplementärer Ansatz zur Analyse der Größe von proteinbeschichteten Nanocarriern.

Mittels Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie (TEM und SEM) ist es möglich, die Proteinkorona zu visualisieren. In TEM-Studien wird eine negative Färbungstechnik (Uranylacetat) zur Kontrasterhöhung verwendet.

Mit der Circulardichroismus-Spektroskopie (CD) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) wird die Sekundärstruktur von Korona-Proteinen untersucht. Zusätzlich wird die Proteinstabilität und -entfaltung durch Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie (Nano Temper Technologies) analysiert. Dies ist eine markierungsfreie Methode, die die intrinsische Tryptophan/Tyrosin-Fluoreszenzintensität eines Proteins beim Erhitzen verfolgt.

Eine weitere gebräuchliche in situ-Methode ist die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Hierbei werden Protein zu einer Nanoträgerlösung titriert und es wird die durch Proteinadsorption entstandene Wärme gemessen. Dadurch lassen sich die Bindungsaffinität, Enthalpie und Stöchiometrie berechnen.

Um die harten Korona Proteine zu analysieren, werden zuerst die losen und ungebundenen Proteine (ex situ) durch Zentrifugation, magnetische Separation oder Größenausschlusschromatographie je nach Trägermaterial entfernt. Die 2D-Gelelektrophorese wurde in anfänglichen Studien verwendet, um das gesamte Koronamuster zu untersuchen. Diese Methode liefert jedoch eine begrenzte Information über die verschiedenen Proteine. Mit den Fortschritten in der Entwicklung neuartiger Techniken im Feld der Massenspektrometrie (LC-MS) ist es jetzt möglich, die genaue Koronazusammensetzung zu identifizieren. Weiterhin werden Proteinassays verwendet, um die absolute Menge an gebundenem Proteinen zu bestimmen. Zeta-Potenzial Messungen werden genutzt, um die Oberflächenladung der Nanoträger nach der Proteinbeschichtung zu bestimmen.

Protein Corona Engineering: Vom Stealth Effekt zum aktiven Targeting

Eines der größten Herausforderungen bei der Verwendung von intravenös applizierte Nanocarriern ist, dass diese rasch von Phagozyten aufgenommen werden. Durch die Adsorption von Immunglobulinen oder Komplementproteinen an die Oberfläche von Nanoträgern oder jedem anderen Fremdmaterial wird deren Erkennung durch Phagozyten vermittelt. Wie anfangs beschrieben, wurde angenommen, dass durch die PEGylierung der Nanocarrier-Oberfläche die Proteinadsorption verhindert werden kann und dies auch der entscheidende Faktor für ein Stealth-Verhalten ist.

Im Jahr 2016 wurde von Schöttler et al. [3] in einer detaillierten proteomischen Analyse die Korona von PEGylierten Nanopartikeln untersucht. Die Ergebnisse waren verblüffend, da gezeigt wurde, dass die Proteinadsorption tatsächlich benötigt wird, um eine Zellaufnahme durch Phagozyten zu verhindern. In Abwesenheit von Proteinen wurden PEGylierte Nanopartikel von Phagozyten schnell internalisiert. Erst nach der Plasmainkubation war die zelluläre Aufnahme von PEGylierten Nanopartikeln erheblich reduziert. Durch LC-MS-Analyse wurde Clusterin als häufigstes Protein (~70%) in der Korona von PEGylierten Nanopartikeln detektiert (Abb. 3). Die Präinkubation von Nanopartikeln mit Clusterin reduzierte die zelluläre Aufnahme in Phagozyten. Dies führte zur Schlussfolgerung, dass „Stealth-Proteine“ (z. B. Clusterin) vorzugsweise an PEG-Partikel adsorbieren und diese auch den Stealth-Effekt vermitteln.

Dies bedeutet auch im weiteren, dass die Proteinkorona ausgenutzt werden kann, um Nanocarrier mit definierten Koronaeigenschaften zu entwickeln und hiermit deren pharmakokinetische Eigenschaften zu verbessern.

Spezifische Zellinteraktionen sind das Ziel von Nanocarriern, die als Wirkstofftransporter eingesetzt werden sollen. Deshalb werden Liganden (z. B. Antikörper) an der Oberfläche der Nanoträger angebracht, um eine spezifische Zellwechselwirkung zu ermöglichen („Targeting“). Der Einfluss der Proteinkorona auf die Targeting-Eigenschaften von Nanoträgern wurde kürzlich von Tonigold et al. [4] untersucht (Abb. 3). Je nach Wahl der Anbindungsstrategie zur Kopplung des Antikörpers an die Nanocarrier Oberfläche, beeinflusste die Proteinkorona die Targeting Eigenschaften erheblich. Nanocarrier, die durch gängige NHS-Chemie kovalent funktionalisiert wurden, konnten die Zielzelle in Gegenwart der Proteinkorona nicht mehr erreichen, wohingegen die Funktionalisierung des Nanoträgers durch einfache Adsorption der Antikörper an deren Oberfläche ein spezifischen Targeting auch in Anwesenheit von 100 % Serum hervorrief. Es wurde gezeigt, dass die Funktionalisierungsstrategie die Orientierung des Antikörpers auf der Oberfläche und damit die Targeting-Effizienz bestimmt.

Zusammenfassung

Das Verständnis und die Kontrolle der Wechselwirkung von Proteinen und Nanoträgern ist der Schlüssel zur Verbesserung ihrer biologischen Eigenschaften. Durch verschiedenste analytische Methoden können die Prozesse an der Nano-Bio-Grenzfläche erforscht werden. Dieses Wissen ist notwendig, um die Eigenschaften der Nanoträger von biologischer Seite zu verändern, wodurch eine erfolgreiche klinische Anwendung ermöglichen werden soll.

Autoren
Johanna Simon1,2, Volker Mailänder1,2, Katharina Landfester1

Zugehörigkeit
1 Max-Planck-Institut für Polymerforschung, Mainz, Deutschland
2 Universitätsmedizin der Johannes-Gutenberg-Universität, Hautklinik und Poliklinik, Mainz, Deutschland

Kontakt
Prof. Dr. Katharina Landfester
MPI für Polymerforschung
Mainz, Deutschland
landfester@mpip-mainz.mpg.de

 

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Referenzen
[1] Lynch I, Salvati A, Dawson KA. Protein-nanoparticle interactions: what does the cell see? Nature nanotechnology 2009, 4:546, doi:10.1038/nnano.2009.248.
[2] Milani S, Bombelli FB, Pitek AS, Dawson KA, Radler J. Reversible versus irreversible binding of transferrin to polystyrene nanoparticles: soft and hard corona. ACS Nano 2012, 6:2532-2541, doi:10.1021/nn204951s.
[3] Schöttler S, Becker G, Winzen S, Steinbach T, Mohr K, Landfester K, Mailander V, Wurm FR. Protein adsorption is required for stealth effect of poly(ethylene glycol)- and poly(phosphoester)-coated nanocarriers. Nature Nanotechnology 2016, doi:10.1038/nnano.2015.330.
[4 Tonigold M, Simon J, Estupiñán D, Kokkinopoulou M, Reinholz J, Kintzel U, Kaltbeitzel A, Renz P, Domogalla MP, Steinbrink K, et al. Pre-adsorption of antibodies enables targeting of nanocarriers despite a biomolecular corona. Nature Nanotechnology 2018:1, doi:10.1038/s41565-018-0171-6.

 

Kontaktieren

Max Planck Institute for Polymer Reserach

Mainz
Deutschland

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