Direkte Erregeridentifikation mit Raman Spektroskopie

Grünes Licht für die Virusdiagnostik

  • Abb.1: AFM Topographie eines Herpes-Zoster-Virus.Abb.1: AFM Topographie eines Herpes-Zoster-Virus.
  • Abb.1: AFM Topographie eines Herpes-Zoster-Virus.
  • Abb. 2: TERS Spektren eines Varizella-Zoster-Virus und schematischer Aufbau dieses Virustyps.

Der heutigen virologischen Diagnostik könnte demnächst eine Alternative zur Verfügung stehen: Die Spitzen-verstärkte Raman Spektroskopie (Tip-Enhanced Raman Scattering - TERS) öffnet den Weg zur direkten Charakterisierung und Unterscheidung von einzelnen Viren. Mit TERS werden Proben auf den Nanometer genau mit einer feinen Nadel abgetastet, gleichzeitig werden dabei chemische Informationen gesammelt.

Bestimmung des Erregers
Diese Daten liefern für jeden Virus charakteristische Informationen, die eine eindeutige Identifikation ermöglichen. Dadurch entfallen Erregervermehrung und Auftrennung in deren Bestandteile und es kann wertvolle Zeit bis zur geeigneten Therapie eingespart werden.

Für eine erfolgreiche Behandlung von virologischen Erkrankungen ist die genaue Kenntnis des Erregers Voraussetzung für eine optimale Therapie. Eine direkte Identifizierung von Viren ist aufgrund ihrer geringen Größe von wenigen Nanometern nicht ohne Weiteres möglich und erfordert eine Mindestmenge viralen Materials. Zum Vergleich: Ein Haar hat einen Durchmesser von 30 - 50 µm und ist somit 100 - 1000 Mal größer als die für das bloße Auge und das Lichtmikroskop nicht sichtbaren Viren.

Gängige biologische Verfahren zur Virusbestimmung benötigen nicht nur eine Mindestanzahl an Erregern, sondern erfordern eine Auftrennung in deren Bestandteile. Für die Virusdiagnostik sind Mediziner nach wie vor auf das Züchten von Zellkulturen angewiesen, wobei die Viren gezielt vermehrt werden - vorausgesetzt es existiert ein Zellkulturmodell für das betreffende Virus. Dieser Vorgang dauert bis zu 14 Tagen, eine Zeitspanne, in der der Patient nur anhand der Symptome behandelt werden kann, nicht jedoch mit einem auf den spezifischen Erreger angepassten Medikament. Bei Erkrankungen mit neuen oder aggressiven humanpathogenen Viren kann ein sofortiges Eingreifen jedoch lebensnotwendig sein. Daher ist es das Ziel, eine Methode zu entwickeln, mit der Einzelviren schnell und effizient identifiziert werden können.

TERS in der Diagnostik
Forscher am Leibniz-Institut für Photonische Technologien (IPHT) in Jena erproben derzeit die Anwendbarkeit der Spitzen-verstärkten Raman Spektroskopie auf diesem Gebiet.

Der Ansatz dieser Methode besteht in der Oberflächen-Strukturaufklärung einzelner Viren auf der Nanometerskala. Im Idealfall ist ein einzelnes Partikel für die Charakterisierung ausreichend, so dass der Erreger lediglich aus der Blutprobe isoliert werden muss, der Schritt einer Vermehrung jedoch entfällt.

Das Besondere an TERS ist die Kombination von Raman Spektroskopie und Rasterkraftmikroskopie (engl. Atomic Force Microscopy - AFM), wodurch eine chemische Charakterisierung der Probe bei gleichzeitiger Korrelation mit der Topographie ermöglicht wird. Als Ergebnis erhält man hoch spezifische, sensitive und ortsaufgelöste Probeninformationen, ideal für die Unterscheidung kleinster Partikel. [1] Wie sieht der experimentelle TERS-Aufbau aus? Vereinfacht kann man sich die AFM-Komponente so vorstellen, dass ein Hebelarm (Cantilever) mit einer feinen Nadel die Probe abtastet. Die Spitze dieser Nadel hat einen Durchmesser von ca. 10 nm und kann somit das Oberflächenprofil der Probe nanometergenau darstellen. Auf diesem Weg ist es im ersten Schritt oft schon möglich Viren anhand ihres „Aussehens" grob zu identifizieren. Abbildung 1 zeigt die Topographie eines Varizella-Zoster-Virus, dem Verursacher von Windpocken und Gürtelrose. Typisch für diesen Erreger ist seine „Spiegelei" ähnliche Form. Doch für Viren gleicher Größe und Morphologie ist diese Methode unzureichend. Dafür wird die zweite Komponente in TERS benötigt.

Raman Fingerabdruck
Die Raman Spektroskopie liefert einen chemischen „Fingerabdruck" der untersuchten Probe. Durch Bestrahlung mit Laserlicht werden die Moleküle zur Schwingung angeregt, das abgestrahlte Streulicht wird gesammelt und gibt genaueste spektrale Informationen über die Zusammensetzung der Substanz. Anhand der erhaltenen Ramanspektren können beispielsweise die in biologischen Proben gängigen Bestandteile wie Proteine, Lipide und DNA unterschieden werden. Eine vorige Isolierung der Komponenten ist nicht zwingend notwendig. Dieses Verfahren wird in Kombination mit der Mikroskopie bereits erfolgreich auf Bakterien angewandt, die ca. 50 Mal größer sind als Viren. [2]

Die Standard Raman Spektroskopie ist sehr spezifisch, aber nicht empfindlich genug, um einzelne Viren zu untersuchen. Darüber hinaus ist sie durch die optische Beugungsgrenze in ihrer lateralen Auflösung begrenzt und kann lediglich Durchschnittsinformationen einer großen Anzahl von Viren liefern. Die benötigte Empfindlichkeit wird durch die Kombination mit der AFM erreicht, wodurch sich die Möglichkeit einer Einzelvirusdetektion eröffnet. Im Labor wird dafür eine versilberte AFM-Spitze zusammen mit der Probe im Laserfokus positioniert. Die Bestrahlung der TERS-Spitze durch den Laser investiert das elektromagnetisches Feld, so dass die Raman-Signale von Molekülen in unmittelbarer Nähe der Spitze tausendfach verstärkt werden. Diese Verstärkung beruht auf der Anregung von Oberflächenplasmonen im Silber (sogenannte Oberflächen-verstärkte Raman Spektroskopie - SERS). Dabei ist die Raman-Signalverstärkung um so höher, je besser Plasmonenresonanz und Laser Anregungswellenlänge übereinstimmen. In langjährigen TERS-Experimenten hat sich für grünes Laserlicht (λ = 532 nm) Silber als sehr gut handhabbar (Leitung, Stabilität, etc.) erwiesen.

Ein Virus genügt
Eine derart gesteigerte Sensitivität erlaubt es, die Probenmenge für eine TERS-Analyse auf wenige Moleküle zu reduzieren. Auf Viren übertragen bedeutet dies, dass theoretisch ein einziges Viruspartikel zur vollständigen Charakterisierung ausreicht. Im Experiment wird dafür eine Virusoberfläche auf den Nanometer genau bei gleichzeitiger Spektrenaquisition abgerastert. Abbildung 2 zeigt das Modell eines Varizella-Zoster-Virus und drei Spektren, die bei einem Experiment auf einem einzelnen Virus aufgenommen wurden. Durch entsprechende Auswertung des kompletten Datensatzes kann ein vollständiges, für jeden Virustypen eigenes spektrales Profil generiert werden. Viren, deren Hülle sich im chemischen Aufbau voneinander unterscheiden, können somit direkt voneinander unterschieden werden. Für Erreger ähnlicher Komposition können multivariate Analysemethoden, wie in der schon oben erwähnten Bakteriendiagnostik zum Einsatz kommen, um kleinste Details in den Datensätzen herauszuarbeiten.

Ausblick
TERS erlaubt eine simultane Charakterisierung der Topographie und der chemischen Zusammensetzung einzelner Viren und stellt eine neuartige nanoanalytische Diagnosetechnik dar, die weder eine Mindestmenge viralen Materials noch eine chemische Probenvorbehandlung benötigt. Auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer Virostatika können mit dieser Methode hilfreiche Informationen gewonnen werden, denn die ersten Wechselwirkungen und strukturellen (molekularen) Änderungen zwischen Virus und Medikament laufen stets an der Oberfläche auf der Nanoskala ab.

Literatur
[1] V. Deckert, GIT-Laborportal, 01.03.2008
[2] J. Popp, GIT-Laborportal, 10.02.2014

Autoren
Dr. Tanja Deckert-Gaudig und Prof. Dr. Volker Deckert sind wissenschaftliche Mitarbeiter der Abteilung „Nanoskopie" am Leibniz-Insitut für Photonische Technologien (IPHT) in Jena.

Kontakt
Prof. Dr. Volker Deckert
Leibniz-Insitut für Photonische Technologien (IPHT)
Jena
volker.deckert@ipht-jena.de

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Raman-Spektroskopie
ICORS 2014: http://bit.ly/ICORS2014
Was ist Raman? http://bit.ly/WasistRaman

 

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