Einzelzellen aus dem Drucker

Dispensiertechnologie als Alternative zu Verdünnungsreihen

  • Die Einzelzelle aus dem Drucker: Dispensiertechnologie als Alternative zu VerdünnungsreihenDie Einzelzelle aus dem Drucker: Dispensiertechnologie als Alternative zu Verdünnungsreihen
  • Die Einzelzelle aus dem Drucker: Dispensiertechnologie als Alternative zu Verdünnungsreihen
  • Abb. 1: Das Funktionsprinzip des Einzelzell-Druckers.
  • Abb. 2: Nachweis der Klonalität. Aufnahmen des Sortier- und Druckprozesses bei A: Vor dem Ausdruck, B: Während des Druckprozesses, C: Während des Druckprozesses und der automatischen Zelldetektion und D: nach dem Druckprozess.
  • Abb. 3: Wachstumsstudie einer mit dem Einzelzell-Drucker isolierten GFP-transfektierten U2OS Zelle (humaner Knochenkrebs), 1) 2 h nach Druck, 2) Tag 1, 3) Tag 4, 4) Tag 10.

Die Separation von Einzelzellen in den Lebenswissenschaften und der Biotechnologie, beispielsweise in der Herstellung klonaler Zelllinien, gewinnt seit Jahren rapide an Bedeutung. Einzelzellen können jedoch meist nur manuell und damit lediglich in geringen Mengen oder nur mit hohem Personal- und Gerätekostenaufwand gewonnen werden. Die Einzelzell-Druck-Technologie könnte diese Hürden in Vergessenheit geraten lassen.

Neben einer Vielzahl von möglichen Anwendungen werden einzelne Zellen für den Prozess der Herstellung monoklonaler Zelllinien sowie bei der genomischen Analyse von Einzelzellen für klinische Anwendungen, wie z.B. der Krebs- und Pränataldiagnostik oder Reproduktionsgenetik benötigt. Standardmäßig werden diese Einzelzellen durch ein manuelles Verdünnungsverfahren gewonnen. Dieser Prozess ist zwar einfach, jedoch mit hohem Personalaufwand verbunden und ist zudem wenig effizient. Eine effiziente Alternative bieten Geräte der Durchflusszytometrie, deren Verwendung jedoch technisch komplex und zudem sehr teuer und zeitaufwendig ist. Der Einzelzell-Drucker Cy-Clone der Firma Cytena vereint Effizienz und Einfachheit und stellt somit eine Alternative zu den bestehenden Methoden dar.

Die Technologie
Der Einzelzell-Drucker besteht aus einem Dreiachs-Laborroboter einem Druckkopf mit Druckkartusche und einer Mikroskop-Optik. Die Funktionsweise ähnelt der eines Tintenstrahldruckers. Die Einweg-Druckkartusche beinhaltet sowohl ein Reservoir, welches eine Zellsuspension von bis zu 100 µl fassen kann, als auch einen Silizium-Glas-Chip zur Tropfenerzeugung. Die Zellprobe wird in das Reservoir pipettiert und befüllt von dort selbstständig den Chip. Mit Hilfe der Mikroskop-Optik und einer schnellen Kamera wird die Probe im Inneren des Chips in Echtzeit analysiert. Die in der Probe befindlichen Zellen werden einzeln detektiert und nach optischen Kriterien wie Größe und Morphologie klassifiziert. Angetrieben durch einen piezo-elektrischen Aktor erzeugt der Drucker nun einzelne, frei fliegende Tropfen mit einem Volumen zwischen 100 pl und 250 pl (s. Abb. 1).

Sollte ein Tropfen keine Zelle, zu viele Zellen oder Zellen enthalten, die nicht den angegebenen Selektionskriterien entsprechen, werden diese durch ein pneumatisches System im Flug abgesaugt. Nur Tropfen mit exakt einer Zelle erreichen somit das Substrat. Gleichzeitig wird der Bildnachweis jeder einzelnen Zelle gespeichert. Somit ist beispielsweise eine 96-Well-Platte in weniger als 10 Minuten mit den erwünschten einzelnen Zellen befüllt. Es besteht völlige Freiheit bezüglich der Sortierkriterien der Zellen und die Wahl des Substrats bleibt dem Nutzer überlassen.

Produktion von monoklonalen Zelllinien:
Der Einzelzell-Drucker adressiert mit seiner Technologie ein breites Einsatzspektrum. So ist neben einem Einsatz in Forschung und Industrie auch eine Ergänzung von Diagnosegeräten denkbar, um relevante Zellen zu identifizieren und zu separieren. Exemplarisch für die Anwendungsmöglichkeiten soll hier nun der Einsatz bei der Produktion von monoklonalen Zelllinien skizziert werden.

Insbesondere bei der Herstellung biologischer Medikamente, zellbasierter Toxizitätsstudien oder Medikamententests ist die Produktion von monoklonalen Zelllinien unverzichtbar. Der typische Standardprozess für diese Herstellung sieht hierbei eine Verdünnungsreihe vor, welche dem Prinzip der statistischen Verteilung unterliegt und die Wahrscheinlichkeit der Existenz einer einzelnen Zelle durch hinreichend hohe Verdünnung der Probe gewährleisten soll. Um jedoch den Ursprung aus der Einzelzelle und damit die Klonalität der späteren Zelllinie mit ausreichender, statistischer Sicherheit zu gewährleisten, sind weitere zeitaufwändige Subklonierungen gefolgt von erneuten Verdünnungsreihen nötig. Der Prozess ist somit stets sehr zeit- und personalintensiv. Die bildgebende Detektion und simultane Speicherfunktion des Einzelzell-Druckers ermöglicht es nun, den Nachweis der Einzelzelle direkt während des Druckvorgangs zu erbringen (s. Abb. 2). Dieser direkte Nachweis der Klonalität ist somit für die Zelllinienherstellung insbesondere in Bezug auf alle internen und externen regulatorischen Anforderungen bahnbrechend. Zusätzlich ist der Vorgang deutlich zeitsparender und effizienter.

Zellkultivierung
Eine erfolgreiche Zellvereinzelung mit dem Einzelzell-Drucker wurde bereits für viele gängige Zelltypen gezeigt. Darunter humane Zelllinien (HEK, B-cells), humane Krebszelllinien (HeLa, U2OS, CaSki, C33a und weitere), tierische Zelllinien (CHO, RBL, 3T3-FIB) sowie Primärzellen (humane Fibroblasten, humane Keratinozyten, humane Gebärmutterhalszellen, neuronale Mauszellen).

Die Aussaat der einzelnen Zellen ist der erste wichtige Schritt in der Herstellung der klonalen Zelllinie. Hierbei ermöglicht der Einzelzell-Drucker die Isolierung durch den Druckvorgang. Die Auswahl, welche Zellen in einem Tropfen ausgedruckt werden, wird anhand der Morphologie getroffen. Der Nutzer gibt hierzu zuvor die erwünschten Parameter an. Durch automatische Aussortierung von Zellfragmenten und Zellclustern erzielt der Drucker zudem eine hohe Reinheit.

Effizienzvergleich
Die Effizienz mit der eine 96-Well-Platte mit einzelnen Zellen befüllt wird, liegt beim Standardprozess der Verdünnungsreihen zwischen 10-30%. Im Vergleich hierzu zeigt ein aktueller Versuch mit drei der oben genannten Zelllinien eine Effizienz von ca. 80% bei Befüllung der Well-Platten mit dem Einzelzell-Drucker. Für diesen Versuch wurden insgesamt 37 96-Well-Platten befüllt. Ein konditioniertes Medium wurde für 13 96-Well-Platten benutzt, welche in der Folge betrachtet werden sollen.

Nach der Aussaat durch den Einzelzell-Drucker bestimmt nun die Wachstumsfähigkeit der einzelnen Zelle sowie das verwendete Medium die Entstehung der gewünschten Zelllinie. Um dies nicht negativ zu beeinflussen ist es, neben weiteren Faktoren wie der Optimierung der Zellkulturlösung, äußerst wichtig, dass die Zellen während des Prozesses schonend behandelt, nicht beschädigt oder anderweitig unter Stress gesetzt werden.

Bei ausgedruckten Einzelzellen durch den Einzelzell-Drucker in ein konditioniertes Medium konnten bereits nach einer Woche bei durchschnittlich 61% der ausgedruckten Einzelzellen das Wachstum einer Zellkolonie festgestellt werden. Dieser Wert beträgt bei Verdünnungsreihen meist nur bis zu 30%. Diese deutliche Verbesserung zeigt, dass die Technologie des Einzelzell-Druckers die Einzelzellen während des Vorgangs sehr schonend behandelt

Zusammenfassung:
Cytenas Einzelzell-Drucker Cy-Clone arbeitet unkompliziert, schnell und effizient. Die Technologie ermöglicht eine deutliche Effizienzsteigerung kombiniert mit sofortiger Qualitätskontrolle in der Zelllinienherstellung. Der Prozess der Herstellung klonaler Zelllinien wird damit entscheidend verbessert. Der Nachweis der Klonalität ist hierbei ein Zugewinn bei der Erfüllung interner und externer regulatorischer Bedingungen.

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