Entzündungen gezielt auflösen

Massenspektrometrie ermöglicht Lipidmediatoranalyse im Pikogrammbereich

  • Abb. 1: Schematischer Überblick über die Polarisierung zu M1- und M2- Makrophagen. Die differenzielle Enzymexpression wurde mittels Western Blot analysiert und die Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie kontrolliert. Abb. 1: Schematischer Überblick über die Polarisierung zu M1- und M2- Makrophagen. Die differenzielle Enzymexpression wurde mittels Western Blot analysiert und die Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie kontrolliert.
  • Abb. 1: Schematischer Überblick über die Polarisierung zu M1- und M2- Makrophagen. Die differenzielle Enzymexpression wurde mittels Western Blot analysiert und die Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie kontrolliert.
  • Abb. 2.: UPLC Chromatogramm für LM aus M1- und M2-Makrophagen nach bakterieller Stimulation. Die Polarität der LM bedingt ihre Auftrennung zu den angegebenen Retentionszeiten. M1 (rot) bilden vor allem proinflammatorische LM wie PGE2 und LTB4, während in M2-Makrophagen (blau) die SPM und 15-LOX Produkte wie 17-HDHA dominieren.
  • Abb. 3: Schematische Übersicht über hemmende und stimulatorische Wirkungen der untersuchten Wirkstoffe auf das LM Profil in humanen M1- und M2-Makrophagen nach bakterieller Stimulation für 180 min bei 37 ° C. Die Modulation (Zunahme = rot; 100% = weiß; Abnahme =blau) des LM-Profils für jede Verbindung ist in einer Heatmap dargestellt.
Der Einfluss von antientzündlichen Wirkstoffen (Nichtsteroidale Antiphlogistika) auf die Lipidmediatorbiosynthese wurde bisher routinemäßig v. a. auf einzelne Enzyme der Entzündungskaskade untersucht. Neben den klassischen proinflammatorischen Lipidmediatoren (LM) bildet jedoch dieselbe Enzymklasse auch die entzündungsauflösenden LM, sogenannte „specialized pro-resolving mediators“ (SPM). Durch eine gezielte Metabolomikanalyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie-Kopplung (UPLC-MS/MS) in humanen Makrophagen können LM im unteren pikomolaren Bereich quantifiziert und damit spezifische LM-Profile für diese Wirkstoffe erstellt werden.
 
Die gezielte Behandlung einer Entzündung ist entscheidend für den Krankheitsverlauf. Kann eine akute Entzündung nicht ausheilen, verläuft diese chronisch und bildet die Grundlage für Erkrankungen wie Arthritis, Atherosklerose, Diabetes und Asthma [1]. Für die Behandlung chronischer Entzündungen werden üblicherweise Arzneistoffe eingesetzt, die die Bildung der pro-inflammatorisch wirkenden Prostaglandine (PG) und Leukotriene (LT) aus der mehrfach ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure (AA) gezielt hemmen. Pharmakologische Ansatzpunkte sind hier vor allem die Inhibierung der Cyclooxygenasen (COX-1/2), durch Nichtsteroidale Antiphlogistika (sog. NSAIDs) wie Ibuprofen oder Celecoxib, sowie der 5-Lipoxygenase (5-LOX) durch Zileuton (Zyflo) oder dessen Helferprotein das 5-LOX-aktivierende Protein (FLAP) durch MK886 [2].  Die Enzymklasse der LOX, zu welcher auch die 15-LOX-1 gehört, bildet neben den klassischen pro-inflammatorischen LM auch die entzündungsauflösenden SPM. Diese werden vor allem aus den Omega-3-Fettsäuren Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) gebildet [3].
Prominente LM-Biosynthese-Inhibitoren (einschließlich NSAIDs) wurden bisher allerdings vor allem in zellbasierten Studien mit eingeschränkter Bandbreite und Sensitivität (meist HPLC) analysiert, wobei hauptsächlich die entzündungsfördernden PG und/oder LT in isolierten Immunzellen wie Neutrophilen, Monozyten oder Makrophagen untersucht wurden. Für die Analytik der SPM bedarf es jedoch eine hochsensitive und eindeutige Detektion sowie das richtige Zellsystem und Stimulus.

Hierfür eignen sich vor allem die anti-inflammatorschen M2-Makrophagen, welche verstärkt 15-LOX-1 exprimieren – das Schlüsselenzym der SPM Biosynthese (Abb. 1) [4]. Weiterhin spielen physiologische Stimuli wie Bakterien (Escherichia coli oder Staphylococcus aureus) für die Auflösung der Entzündung eine entscheidende Rolle [5].

 
Auflösung, Sensitivität und Geschwindigkeit
Die entzündungshemmenden, mehrfach hydroxylierten SPM aus DHA und EPA wie die Resolvine, Maresine und Protektine sind bei 1000-fach niedrigeren Konzentrationen bioaktiv als die klassischen pro-inflammatorischen Botenstoffe PGE2 und LTB4 aus AA [6]. Die komplexe Stereochemie der SPM bedingt jedoch auch deren anspruchsvolle Analytik: (I) Extraktion mittels Festphase (Sep-Pak Vac 6cc 500 mg/ 6 ml C18; Waters, Milford, MA), (II) die Auftrennung mittels Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC, Acquity UPLC System, Waters) und (III) Detektion / Quantifizierung anhand von mindestens zwei spezifischen Multiple Reaction Monitoring (MRM) Übergängen mittels QTRAP 5500 Massenspektrometer, ABSciex. Die Vorteile der chromatographischen Trennungen mittels UPLC sind eine außerordentlich hohe Auflösung, Sensitivität und Geschwindigkeit mit entsprechend hohem Probendurchsatz in der Praxis. Die Kopplung mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer als Detektor erlaubt die eindeutige Identifizierung anhand der LM-spezifischen MRM in einem gewissen Zeitfenster (Retentionszeit). Beim MRM werden die gewünschten Analyt-Ionen von einem Massenfilter (Quadrupol 1) selektiert, durch Kollision mit Stickstoffmolekülen fragmentiert (Quadrupol 2) und ein spezifisches Fragment durch einen zweiten Massenfilter (Quadrupol 3) zum Detektor geleitet. Die Abb. 2 zeigt die Auftrennung und die Retentionszeit von LM aus stimulierten M1- und M2-Makrophagen in einem repräsentativen UPLC-Chromatogramm. Mittels Methanol/Wasser Gradient co-eluieren möglichst wenige LM gleichzeitig. Dadurch müssen nur noch wenige Massen zur gleichen Zeit gemessen werden, was wiederum zu einer höheren Sensitivität führt. In einem einzigen Lauf können so über 35 LM mit zwei oder mehr spezifischen MRM-Übergängen detektiert und quantifiziert werden.
 
Verbesserte Einschätzung des therapeutischen Potenzials
Hier zeigen wir, wie prominente LM-Biosynthesewege in humanen pro-inflammatorischen M1- und anti-inflammatorischen M2-Makrophagen durch Wirkstoffe differenziell moduliert werden können. Während M1-Makrophagen sich aufgrund einer erhöhten Expression der COX-2, 5-LOX und FLAP vor allem für die Untersuchung pro-inflammatorischer LM eignen, stellen die M2-Makrophagen aufgrund der hohen 15-LOX-1 Expression ein ideales Zellmodell für die pharmakologische Modulation der anti-inflammatorischen SPM dar (Abb. 1). Neben den zu erwarteten Wirkungen fanden wir, dass (I) COX oder 15-Lipoxygenase-1 Inhibitoren die pro-inflammatorischen Leukotrienspiegel drastisch erhöhen, (II) 5-LOX und FLAP Inhibitoren die Leukotrienbiosynthese wie erwartet hemmen, allerdings vorzugsweise in M1-Makrophagen, (III) FLAP Inhibitoren erhöhen gleichzeitig signifikant die anti-inflammatorischen SPM Spiegel in M2-Makrophagen und (IV) der 15-Lipoxygenase-1 Inhibitor 3887 blockiert spezifisch die 15-LOX-1-vermittelte SPM Biosynthese in M2-Makrophagen (Abb. 3; Originalpublikation [7]). Die Hemmung der LM-bildenden Enzyme wirkt sich somit unterschiedlich auf das LM Profil in den verschiedenen Makrophagenphänotypen aus, was beträchtliche Konsequenzen für deren Einsatz in der Pharmakotherapie im Hinblick auf die Auflösung der Entzündung hat.
Unsere Ergebnisse ermöglichen somit eine bessere Einschätzung des therapeutischen Potenzials bereits etablierter als auch neuer Arzneimittel, die bei der Therapie entzündlicher Erkrankungen eingesetzt werden.

 

Autoren
Paul M. Jordan1, Markus Werner1, Oliver Werz1, Jana Gerstmeier1

Zugehörigkeiten
1Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische Chemie, Institut für Pharmazie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland

 

Kontakt
Dr. Jana Gerstmeier

Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische Chemie
Institut für Pharmazie
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Jena, Deutschland
jana.gerstmeier@uni-jena.de

 

Mehr Artikel zur Massenspektrometrie!

 

Literatur
1. Tabas, I. and C.K. Glass, Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science, 2013. 339(6116): p. 166-72.
2. Rainsford, K.D., Anti-inflammatory drugs in the 21st century. Subcell Biochem, 2007. 42: p. 3-27.
3. Serhan, C.N., N. Chiang, and J. Dalli, The resolution code of acute inflammation: Novel pro-resolving lipid mediators in resolution. Semin Immunol, 2015. 27(3): p. 200-15.
4. Werz, O., et al., Human macrophages differentially produce specific resolvin or leukotriene signals that depend on bacterial pathogenicity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 59.
5. Chiang, N., et al., Infection regulates pro-resolving mediators that lower antibiotic requirements. Nature, 2012. 484(7395): p. 524-8.
6. Serhan, C.N., N. Chiang, and T.E. Van Dyke, Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and pro-resolution lipid mediators. Nat Rev Immunol, 2008. 8(5): p. 349-61.
7. Werner, M., et al., Targeting biosynthetic networks of the proinflammatory and proresolving lipid metabolome. FASEB J, 2019: p. fj201802509R.

Kontaktieren

Friedrich-Schiller-Universität Jena


Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.