Fluoreszenzsensoren für die DNA-Spaltung

Sensitive Assays für den Hochdurchsatz

  • Abb. 1: Metallkomplexe, die an DNA binden bzw. diese spalten – Cisplatin (links), der Fe(II)-Komplex von Bleomycin (Mitte) und die Cu(II)-Komplexe von Phenanthrolin und Glycylglycylhistidin (rechts).Abb. 1: Metallkomplexe, die an DNA binden bzw. diese spalten – Cisplatin (links), der Fe(II)-Komplex von Bleomycin (Mitte) und die Cu(II)-Komplexe von Phenanthrolin und Glycylglycylhistidin (rechts).
  • Abb. 1: Metallkomplexe, die an DNA binden bzw. diese spalten – Cisplatin (links), der Fe(II)-Komplex von Bleomycin (Mitte) und die Cu(II)-Komplexe von Phenanthrolin und Glycylglycylhistidin (rechts).
  • Abb. 2: Molecular Beacon zum DNA-Nachweis und Molecular Break Light zum Nachweis von DNA-Spaltung.
  • Abb. 3: Links: Nachweis von Hydroxylradikalen und H2O2 (ROS, die bei der oxidativen DNA-Spaltung eine Rolle spielen) mit den Fluorogenen TPA und PBSF in Anwesenheit von Ascorbat (asc). Rechts: Nachweis der Redoxaktivität des nucleolytischen Cu(II)-Ions mit einem ATCUN-Peptid R-Dap-β-Ala-His-Ser-Ser-CONH2 (R=Dansyl, Rhodamin B oder Fluorescein) – nicht fluoreszierend für Cu(II), fluoreszierend für Cu(I).
Die Spaltung von DNA spielt eine wichtige Rolle in Biologie und Medizin: bei der Vervielfältigung und Reparatur dieses Biomoleküls oder bei dessen Abbau in der Zelle, bei der Manipulation von genetischem Material oder bei der Sequenzierung, aber auch als Methode, um Krebszellen abzutöten. Während die Natur für die zellulären Prozesse Enzyme einsetzt, sind für die Molekularbiologie und medizinische Anwendungen auch kleine Moleküle denkbar. So spaltet Bleomycin (Abb. 1 Mitte) DNA in Gegenwart von Metallionen wie Fe(II) derart effizient, dass es zu diesem Zweck in der Krebsmedizin eingesetzt wird [1]. Viele andere Krebsmedikamente hingegen wirken nicht durch Spaltung der DNA, sondern nur durch Bindung an diese (z.B. Cisplatin, Abb. 1 links).
 
Ähnlich wie der Fe(II)-Komplex des Bleomycins verursachen Cu(II)-Komplexe aufgrund ihrer Redoxaktivität den Abbau von DNA und sind deshalb für die Entwicklung neuartiger Chemotherapeutika ebenso interessant. Im Falle der Cu(II)-Komplexe kommt es nach Reduktion des Metallzentrums durch ein Reduktionsmittel wie Glutathion oder Ascorbat zur Bildung von Cu(I), welches mit Luftsauerstoff im Folgeschritt die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) initiiert, die dann die DNA angreifen. Im Gegensatz zu Nuclease-Enzymen – den natürlichen DNA-Spaltern, die die DNA hydrolytisch am Phostphatesterrückgrat spalten, liegt hier eine oxidative DNA-Spaltung zugrunde. Zum Beispiel weisen die Cu(II)-Komplexe des Phenanthrolins und von ATCUN-Peptiden (aminoterminales Cu(II)- und Ni(II)-bindendes Motiv) wie Glycylglycylhistidin (GGH) (Abb. 1 rechts) eine solche Aktivität auf. Da mit der oxidativen DNA-Spaltaktivität eine zytotoxische Wirkung einhergeht, werden solche Komplexe ebenfalls als potentielle Chemotherapeutika diskutiert [2]. Um DNA-Spaltung sowohl sensitiv nachweisen zu können als auch mechanistisch zu verstehen, eignen sich Fluoreszenzmethoden, die im Folgenden vorgestellt werden sollen.
 
Nachweis von DNA-Spaltaktivität
Neben linearen Fluorophor-markierten Oligonukleotiden [3] eignen sich zur Detektion von DNA-Spaltung „Molecular Beacons“ („molekulare Leuchtfeuer“) besonders gut, auch wenn sie ursprünglich eigentlich für die Detektion von DNA entwickelt wurden [4].

Diese Oligonukleotide weisen eine Sequenz auf, die ihnen eine Haarnadelstruktur bestehend aus einem Stamm- und einem Schleifenteil verleiht. Zueinander komplementäre Basenpaare am 3’- und 5’-Ende bilden den Stamm und tragen ein Fluorophor bzw. einen Quencher (Abb. 2). In „geschlossenem“ Zustand fluoresziert das Molecular Beacon aufgrund der räumlichen Nähe von Fluorophor und Quencher nicht (FRET-Effekt). Bei Hybridisierung der Schleifensequenz mit der nachzuweisenden komplementären DNA kommt es zur Öffnung des Molecular Beacons und damit zur Fluoreszenz (Abb. 2). Ebenso ist dieses Konzept für den Nachweis der DNA-Spaltung anwendbar [5], denn eine Spaltung durch enzymatische oder nicht-enzymatische Nucleaseaktivität führt zu räumlicher Trennung von Quencher und Fluorophor und damit zur Vergrößerung des Fluoreszenzsignals. Während die Schleifenstruktur als Substrat für Einzelstrang-DNasen verwendet werden kann [6], kann der Stamm als Substrat für Restriktionsenzyme dienen – entsprechende Erkennungssequenzen können beim Design der Sonden berücksichtigt werden [5]. Die für den Nachweis der DNA-Spaltung optimierten Systeme sind auch als „Molecular Break Lights“ (für engl. „break“ brechen, d.h. DNA-Strangbruch) in der Literatur bekannt (Abb. 2). Mit diesen Sonden konnte die Nucleaseaktivität von Endiinen, Fe(II)-Komplexen von Bleomycin und EDTA sowie Endonuclease BamHI erfolgreich nachgewiesen werden. Molecular Break Lights weisen gegenüber den herkömmlichen Molecular Beacon-Assays ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis und eine höhere Empfindlichkeit auf. Das Fluoreszenzsignal korreliert dabei mit dem Ausmaß an DNA-Spaltung [7].

Ebenfalls mit dem FRET-Effekt arbeitet ein Gold-Nanopartikel-basiertes System: das Fluorophor eines immobilisierten Oligonucleotids fluoresziert erst nach Hybridisierung mit komplementärer DNA und anschließender Spaltung der dsDNA durch S1-Nuclease und damit Entfernung vom quenchenden Nanopartikel [8]. Anstelle von Gold-Nanopartikeln können auch CdSe/ZnS-Quantenpunkte (quantum dots) eingesetzt werden, wobei hier die komplementäre DNA fluoreszenzmarkiert ist. Aufgrund des FRET-Effekts wird erst bei Behandlung mit DNase I die Fluoreszenz wiederhergestellt und erlaubt so den Nachweis über die DNA-Spaltung [9]. Der Nachweis der Spaltung von G-Quadruplex-DNA, z.B. durch Hydroxylradikale und Porphyrin-Derivate, gelingt mit entsprechenden Fluorophor-markierten Oligonucleotiden. Das Assay ist für die Identifikation von G-Quadruplex-Spaltern einsetzbar, die als Therapeutika entwickelt werden sollen, oder dazu dienen sollen, die Bildung und Auflösung dieser Strukturen in Zellen zu verstehen [10].
Ganz ohne Markierung der DNA kommt ein kationisches, fluoreszierendes Polymer als Sonde aus, dessen Fluoreszenz von Wolframdisulfid-Nanosheets mit negativ geladener Oberfläche gequencht wird. Bei Wechselwirkung des Polymers mit ssDNA kommt es zur Fluoreszenz, in Anwesenheit von Nucleasen (z.B. S1-Nuclease, Hydroxylradikale) jedoch zu einer Abschwächung des Signals aufgrund erneuter Adsorption des Polymers auf der quenchenden Oberfläche [11]. Der Nachweis sowohl von DNA als auch von Nucleasen gelingt mit Ammonium-substituiertem Silol, welches aggregationsinduzierte Emission (AIE) aufweist. Das Fluoreszenzsignal wird beim Mischen mit DNA deutlich größer, in Anwesenheit von S1-Nuclease jedoch nicht [12].
 
Mechanistische Untersuchungen
DNA-Spaltaktivität kann durch Agarosegelelektrophorese mit plasmidischer DNA als Modell auf einfache Art und Weise nachgewiesen werden [13]. Um herauszufinden, welche ROS an einer oxidativen DNA-Spaltung beteiligt sind, können Quencher ebendieser ROS hinzugegeben und deren Wirkung auf die DNA-Spaltung im Agarosegel verfolgt werden (z.B. DMSO und  tBuOH für Hydroxylradikale, NaN3 für Singulettsauerstoff, Pyruvat für H2O2 und Superoxiddismutase (SOD) für Superoxidradikalanionen). Neuere Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese weit verbreiteten Quencher weder selektive noch reproduzierbare Ergebnisse liefern [14]. Ein Fluoreszenzassay, das selektiv, sensitiv und reproduzierbar zwei der Hauptspezies nachweisen kann, zeigte sich damit dem herkömmlichen Gel-Quenchassay überlegen (Abb. 3 links). Für den Fe(II)-Komplex von Bleomycin und drei verschiedene Cu(II)-Komplexe, u.a. [Cu(phen)2]2+ (Abb. 1), gelang mit den Fluorogenen TPA (Terephthalat) und PBSF (Pentafluorbenzolsulfonylfluorescein) der Nachweis von Hydroxylradikalen und H2O2 durch Oxidation bzw. Perhydrolyse [14].
Hydroxylradikale und deren DNA-Spaltaktivität konnten auch mit einem Graphenoxid-basierten System nachgewiesen werden – Graphenoxid dient hier als Quencher für Fluorophore an der ssDNA, sodass Fluoreszenz bei DNA-Spaltung entsteht [15].
Neben der Untersuchung beteiligter ROS ist die Redoxaktivität des involvierten Metallions von Interesse für die Aufklärung von oxidativen DNA-Spaltmechanismen. Dazu nutzten wir ein Derivat des GGH-Tripeptids (Abb. 1), R-Dap-β-Ala-His-Ser-Ser-CONH2 (Dap=2,3-Diaminopropansäure), was am N-Terminus mit einem Fluorophor versehen ist. Die oxidative DNA-Spaltaktivität des ursprünglich nicht-fluoreszierenden Cu(II)-Pentapeptids war aufgrund des Auftretens von Cu(I) von Fluoreszenz begleitet (Abb. 2 rechts). Mit diesem System konnten also Funktion (oxidativer DNA-Spalter) und redoxsensitiver Reporter (Fluorophor) in einem Molekül vereint werden. Dass das Quenching reversibel ist, zeigte die abwechselnde Zugabe von Ascorbinsäure (Reduktion zu Cu(I)) und H2O2 (Reoxidation zu Cu(II)) [16].
 
 
Fazit
Der fluorimetrische Nachweis von DNA-Spaltung ist durch die vorgestellten kontinuierlichen und sensitiven Assays im Hochdurchsatz möglich und damit von Interesse für die Pharmaforschung, da so Proteine oder kleine Moleküle als DNA-Spalter identifiziert werden können. Fluoreszenzsensoren eignen sich ebenso für die Untersuchung von Mechanismen der DNA-Spaltung – potentiell auch in der Zelle.

 

Autorin
Nora Kulak
 

Kontakt
Prof. Dr. Nora Kulak

Institut für Chemie und Biochemie
Freie Universität Berlin
Berlin, Deutschland
nora.kulak@fu-berlin.de

 

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Literatur

[1] J. Chen, J. Stubbe, Bleomycins: new methods will allow reinvestigation of old issues, Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 175–181 (2004), DOI: 10.1016/j.cbpa.2004.02.008. J. Chen, M. K. Ghorai, G. Kenney, J. Stubbe, Mechanistic studies on bleomycin-mediated DNA damage: multiple binding modes can result in double-stranded DNA cleavage, Nucleic Acids Res. 36, 3781–3790 (2008), DOI: 10.1093/nar/gkn302.
[2] C. Wende, C. Lüdtke, N. Kulak, Copper Complexes of N‐Donor Ligands as Artificial Nucleases, Eur. J. Inorg. Chem., 2597–2612 (2014), DOI: 10.1002/ejic.201400032.
[3] S. P. Lee, D. Porter, J. G. Chirikjian, J. R. Knutson, M. K. Han, A Fluorometric Assay for DNA Cleavage Reactions Characterized with BamHI Restriction Endonuclease, Anal. Biochem. 220, 377–383 (1994), DOI: 10.1006/abio.1994.1353. S. P. Lee, M. K. Han, Fluorescence assays for DNA cleavage, Methods Enzymol. 278, 343–363 (1997), DOI: 10.1016/S0076-6879(97)78019-4.
[4] S. Tyagi, F. R. Kramer, Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization, Nature Biotechnol. 14, 303–308 (1996), DOI: 10.1038/nbt0396-303.
[5] C. J. Yang, J. J. Li, W. Tan, Using Molecular Beacons for Sensitive Fluorescence Assays of the Enzymatic Cleavage of Nucleic Acids. In: V. V. Didenko (eds) Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes. Methods in Molecular Biology™, vol 335. Humana Press 2006, DOI: 10.1385/1-59745-069-3:71.
[6] J.J. Li, R. Geyer, W. Tan, Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA, Nucleic Acids Res. 28, e52 (2000), DOI: 10.1093/nar/28.11.e52.
[7] J. B. Biggins, J. R. Prudent, D. J. Marshall, M. Ruppen, J. S. Thorson, A continuous assay for DNA cleavage: The application of “break lights” to enediynes, iron-dependent agents, and nucleases, Proc. Nat. Acad. Sci. 97, 13537–13542 (2000), DOI: 10.1073/pnas.240460997.
[8] P. C. Ray, A. Fortner, G. K. Darbha, Gold Nanoparticle Based FRET Asssay for the Detection of DNA Cleavage, J. Phys. Chem. B 110, 20745–20748 (2006), DOI: 10.1021/jp065121l.
[9] R. Gill, I. Willner, I. Shweky, U. Banin, Fluorescence Resonance Energy Transfer in CdSe/ZnS−DNA Conjugates:  Probing Hybridization and DNA Cleavage, J. Phys. Chem. B 109, 23715–23719 (2005), DOI: 10.1021/jp054874p.
[10] M. Schoonover, S. M. Kerwin, A Fluorescence-Based G-Quadruplex DNA Cleavage Assay, Frontiers in Nucleic Acids ACS Symposium Series, Vol. 1082, Chapter 2, pp 13–32, DOI: 10.1021/bk-2011-1082.ch002.
[11] J. Li, Q. Zhao, Y. Tang, Label-Free Fluorescence Assay of S1 Nuclease and Hydroxyl Radicals Based on Water-Soluble Conjugated Polymers and WS2 Nanosheets, Sensors 16, 865 (2016). DOI: 10.3390/s16060865.
[12] M. Wang, D. Zhang, G. Zhang, Y. Tang, S. Wang, D. Zhu, Fluorescence Turn-On Detection of DNA and Label-Free Fluorescence Nuclease Assay Based on the Aggregation-Induced Emission of Silole, Anal. Chem. 80, 6443–6448 (2008), DOI: 10.1021/ac801020v.
[13] C. Perera, J. Hormann, N. Kulak, GIT Labor-Fachzeitschrift 57, 448–450 (2013)
[14] S. Leichnitz, J. Heinrich, N. Kulak, A fluorescence assay for the detection of hydrogen peroxide and hydroxyl radicals generated by metallonucleases, Chem. Commun. 54, 13411–13414 (2018), DOI: 10.1039/C8CC06996D.
[15] W. T. Huang , W. Y. Xie , Y. Shi , H. Q. Lu, N. Bing Li, A simple and facile strategy based on Fenton-induced DNA cleavage for fluorescent turn-on detection of hydroxyl radicals and Fe2+, J. Mater. Chem. 22, 1477–1481 (2012), DOI: 10.1039/C1JM14276C.
[16] C. Wende, N. Kulak, Fluorophore ATCUN complexes: combining agent and probe for oxidative DNA cleavage, Chem. Commun. 51, 12395–12398 (2015), DOI: 10.1039/C5CC04508H.

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