Herstellung viraler Impfstoffe

Anwendung von kontinuierlichen Chromatographiemethoden

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des klassischen SMB-Prozesses. In jeder Zone befinden sich eine oder mehrere Säulen. Das binäre Gemisch (A + B) tritt zwischen Zone II und III in das System ein. Die schwächer wechselwirkende Komponente A verlässt das System am Raffinatausgang. Die stärker wechselwirkende Komponente B befindet sich im Extraktstrom. Die beiden an der Trennung beteiligten Zonen (Zone II und III) sind durch Schraffuren gekennzeichnet.Abb. 1: Schematische Darstellung des klassischen SMB-Prozesses. In jeder Zone befinden sich eine oder mehrere Säulen. Das binäre Gemisch (A + B) tritt zwischen Zone II und III in das System ein. Die schwächer wechselwirkende Komponente A verlässt das System am Raffinatausgang. Die stärker wechselwirkende Komponente B befindet sich im Extraktstrom. Die beiden an der Trennung beteiligten Zonen (Zone II und III) sind durch Schraffuren gekennzeichnet.
  • Abb. 1: Schematische Darstellung des klassischen SMB-Prozesses. In jeder Zone befinden sich eine oder mehrere Säulen. Das binäre Gemisch (A + B) tritt zwischen Zone II und III in das System ein. Die schwächer wechselwirkende Komponente A verlässt das System am Raffinatausgang. Die stärker wechselwirkende Komponente B befindet sich im Extraktstrom. Die beiden an der Trennung beteiligten Zonen (Zone II und III) sind durch Schraffuren gekennzeichnet.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung des eingesetzten Prozesses zur Aufreinigung von Influenzaviren hergestellt in Zellkultur.

Schutzimpfungen sind seit vielen Jahrzehnten ein wichtiges Mittel zur Prävention und Kontrolle viraler Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel Kinderlähmung, Influenza, Hepatitis oder Gebärmutterhals-Krebs (HPV).

In den vergangen Jahren ist der Markt für Impfstoffe stetig gewachsen. Dies ist zum einen auf die Einführungen neuer Impfstoffe und zum anderen auf die zunehmende Akzeptanz von Impfungen für Erwachsene zurückzuführen. Dementsprechend werden die Herstellungsprozesse fortwährend weiterentwickelt, um unter dem stetig wachsenden Kostendruck im Gesundheitswesen effiziente und sichere Produktionstechnologien zu gewährleisten. Ein gutes Beispiel ist die Entwicklung neuer Herstellungsverfahren für Influenzaimpfstoffe basierend auf Zellkulturtechnik. Diese zeichnen sich gegenüber der konventionelle Methode basierend auf bebrüteten Hühnereiern vor allem durch eine flexiblere Produktionsplanung sowie gesteigerte Kapazitäten aus. Dadurch hofft man, in Zukunft sowohl den weltweit steigenden Bedarf an saisonalen Grippevakzinen zu decken als auch im Fall einer Pandemie innerhalb kürzester Zeit ausreichend Impfstoff produzieren zu können [1].

Um Verbesserungen im Bereich der Virusproduktion (Upstream Processing) voll nutzen zu können, ist auch eine Weiterentwicklung von Strategien zur anschließenden Aufreinigung der Viruspartikel (Downstream Processing) notwendig. In vielen Fällen wurden die bereits etablierten Methoden an aktuelle Zulassungsanforderungen angepasst ohne weitere Optimierungsschritte vorzunehmen [2]. Daher gilt das Downstream Processing heute in vielen Herstellungsverfahren als limitierender Faktor hinsichtlich Durchsatz und Kapazität, und macht damit nicht selten einen Großteil der gesamten Produktionskosten aus. Um diese Situation im Sinne effizienter Gesamtprozesse zu verbessern, ist neben der Etablierung von Aufreinigungsstrategien mit hoher Produktivität eine bessere Vernetzung der einzelnen Prozessschritte notwendig.

Downstream Processing
Das Ziel des Downstream Processing bei der Herstellung biologischer Produkte besteht in der Abtrennung von prozess- und produktspezifischen Verunreinigungen [2].

Prozessbedingte Kontaminationen sind dabei zurückzuführen auf Zellkulturmedien und Zusatzstoffe sowie auf Wirtszellen (Zelltrümmer, Wirtszell-Proteine und -DNA, Lipide) und Rückstände vorheriger Verfahrensschritte (z. B. Mikrocarrier). Zu den produktspezifischen Verunreinigungen zählen vor allem freie Proteine und Produktaggregate. Bei der Entwicklung von geeigneten Aufreinigungsstrategien müssen dabei neben dem oben genannten Bedarf an effizienten Methoden auch strenge behördliche Anforderungen an die Reinheit und Sicherheit des Endprodukts berücksichtigt werden, die in den amtlichen Arzneibüchern (Pharmakopöen) genau festgelegt sind.

Zu den etablierten Techniken des Downstream Processing im industriellen Maßstab zählen Filtrations- und Zentrifugationsmethoden, die eine kontinuierliche Betriebsweise ermöglichen und eine gute Skalierbarkeit aufweisen. Sie werden unter anderem am Anfang des Aufreinigungsprozesses für die Grobklärung, also die Entfernung von Mikrocarriern, Wirtszellen sowie Zellbruchstücken und für die Konzentrierung des Produkts eingesetzt. Zentrifugationstechniken, insbesondere die kontinuierliche Dichtegradienten-Zentrifugation, werden darüber hinaus auch für intermediäre Reinigungsschritte, wie zum Beispiel das Abreichern von Proteinen und Wirtszell-DNA angewandt.

Eine weitere essentielle Technik ist die Batch-Chromatographie, die sich im Vergleich zu anderen Aufarbeitungsmethoden durch eine hohe Selektivität auszeichnet. Aufgrund der unterschiedlichen Interaktionsmechanismen kann eine chromatographische Trennung für eine Vielzahl an spezifischen Aufarbeitungsproblemen etabliert werden. In der Regel wird dazu die klassische Säulenchromatographie mit einer stationären Phase (Matrix) aus porösen Feststoffpartikeln eingesetzt. Eine Auftrennung erfolgt dabei durch unterschiedlich starke Wechselwirkung der Komponenten mit den funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der stationären Phase (Adsorptionschromatographie) oder durch eine einfache Klassierung nach der Molekülgröße oder genauer: dem hydrodynamischen Durchmesser (Größenausschlusschromatographie). Die Kapazität solcher Matrizen für die relativ großen Viruspartikel ist jedoch begrenzt und dementsprechend die Produktivität gering [2]. Des Weiteren ist die Skalierung auf den Prozessmaßstab kostenintensiv und der Durchmesser der Säulen ist durch die Stabilität des gepackten Betts begrenzt, wodurch in Grenzfällen parallele Ansätze genutzt werden müssen.

In den vergangen Jahren wurden daher vermehrt Anstrengungen unternommen, diese Probleme zum Beispiel durch Verbesserungen der stationären Phasen zu lösen. Ein Ansatz hierbei ist die Entwicklung stabilerer Feststoffpartikel, welche größere Poren ermöglichen. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von bi- oder multifunktionalen Feststoffpartikeln [2]. Diese besitzen nur in den Poren funktionalisierte Strukturen, an denen die Kontaminaten adsorbieren, während makromolekulare Substanzen oder Viren nicht in die Poren eindringen und folglich mit der inerten Oberfläche der Partikel nicht interagieren. Dadurch kann die Produktausbeute und der Durchsatz potentiell erhöht werden. Neben optimierten partikulären Matrizen stehen auch alternative Designs wie Membranadsorber und Monolithen für chromatographische Anwendungen zur Verfügung [2]. Diese weisen aufgrund ihrer Struktur eine erhöhte mechanische Stabilität, einen besseren Massetransport und eine erweiterte Kapazität für große Moleküle auf. Somit ermöglichen sie einen höheren Durchsatz, insbesondere wenn Zielkomponenten im Laufe des Prozesses an die stationäre Phase adsorbiert werden.

Ein alternativer Ansatz zur Verbesserung der Prozessproduktivität ist der Einsatz von kontinuierlichen Systemen.

Kontinuierliche Chromatographie
Eine etablierte Methode zur Realisierung kontinuierlicher Chromatographie ist das sogenannte Simulated Moving Bed (SMB) Verfahren. Bei diesem werden mehrere Chromatographiesäulen in einer Kreisschaltung angeordnet (Abb. 1). Durch periodische Weiterschaltung der Ein- und Ausgangsströme wird eine Gegenbewegung zwischen stationärer und mobiler Phase simuliert und dadurch die kontinuierliche Trennung eines binären Gemisches erreicht. Anwendung findet die SMBChromatographie bisher hauptsächlich in der petrochemischen- und der Zuckerindustrie sowie in der pharmazeutischen Industrie, wo sie zur Aufreinigung von komplexen Wertstoffen, zum Beispiel zur Trennung von Enantiomeren eingesetzt wird [3]. Gegenüber der konventionellen diskontinuierlichen Säulenchromatographie wird dabei meist eine höhere Reinheit und Konzentrierung des Produkts, sowie eine größere Produktivität und geringerer Verbrauch an Lösungsmittel erzielt.

Dass die SMB-Chromatographie trotz dieser offensichtlichen Vorteile bisher kaum Anwendung für die Aufreinigung biologischer Moleküle gefunden hat, liegt vor allem an der Limitierung bei klassischen SMB-Prozessen auf die isokratische Trennung von binären und pseudobinären Gemischen. Durch zahlreiche Modifikationen der bestehenden Technik und die Entwicklung neuer Konzepte ist das SMB-Verfahren mittlerweile jedoch flexibler einsetzbar und zunehmend interessant für die Aufreinigung biologischer Produkte aus komplexen Gemischen [4].

Zu den in den letzten Jahren durchgeführten Studien zur Aufreinigung biologischer Moleküle mittels SMB-Chromatographie gehörten insbesondere Prozesse zur Trennung von Proteinen [5 – 9], Plasmid-DNA [10] und viralen Partikeln [11] im Labormaßstab. Dabei kam ein breites Spektrum an Chromatographiemethoden (Größenausschluss, Ionenaustausch, Affinität, Hydrophobizität) und SMB-Konfigurationen zum Einsatz. Die berichteten Ergebnisse sind vielversprechend: gegenüber der herkömmlichen diskontinuierlichen Chromatographie konnte sowohl die Produktivität als auch die Ausbeute des Zielprodukts deutlich gesteigert werden.

Der größte Nachteil der SMB-Chromatographie ist dessen umfangreiche Komplexität im Vergleich zu klassischen Batchverfahren. Dadurch ergeben sich höhere Anforderungen an Prozessdesign und -kontrolle, welche eine Schlüsselrolle für eine erfolgreiche und robuste Trennung darstellen, sowie an die Prozessvalidierung. Die Zweckmäßigkeit der Anwendung kontinuierlicher SMB-Chromatographie für einen Aufreinigungsprozess wird daher unter anderem von folgenden Faktoren abhängig sein: der Komplexität des spezifischen Aufarbeitungsproblems, dem Prozessschritt, dem Volumen und der Produktkonzentration des Eingangsstroms, dem Wert des Produkts, der Häufigkeit des Einsatzes sowie der Betriebsweise (isokratisch oder Gradient, cleaning in place).

Das Downstream Processing von Impfstoffen aus Zellkulturen stellt durch die komplexe Zusammensetzung der Ernten aus Bioreaktoren eine große Herausforderungen an den Einsatz der SMB-Technologie dar. Für solche komplexen Gemische kann die SMB-Technologie nur dann effizient angewendet werden, wenn die Chromatographiebedingungen so ausgelegt sind, dass der Hauptbestandteil der Kontaminanten an einem Ausgangsport gemeinsam eluiert. Vorteilhaft wirkt sich dagegen aus, dass z. B. bei der Herstellung von Influenzaimpfstoffen mit zeitlich limitierten Produktionsfenstern und hohen Prozessvolumina der Einsatz von SMB-Systemen hohe Produktdurchsätze ermöglicht.

SMB für Grippeviren
Derzeitig werden am MPI für Dynamik komplexer technischer Systeme kontinuierliche SMB-Chromatographietechniken für die Aufreinigung von Influenzaviren aus Zellkulturen zur Herstellung von Grippeimpfstoffen entwickelt. Die Produktion der Influenzaviren erfolgt in adhärenten Säugerzellen (Madin Darby Canine Kidney – MDCK Zellen) auf Mikrocarriern [12]. Nach mehreren Filtrationsschritten zur Grobklärung des Kulturüberstands und einer chemischen Inaktivierung werden die Viruspartikel durch Einsatz eines Ultrafiltrationsverfahrens konzentriert (Abb. 2).

Zur Abtrennung kontaminierender Proteine und Wirtszell-DNA wird zurzeit die Verwendung eines SMB-Systems mit isokratischer Größenausschlusschromatographie untersucht. Die Produktausbeute und -reinheit sowie die Produktivität der Methode werden mit denen der konventionellen Einzelsäulenchromatographie verglichen. In zukünftigen Experimenten sollen des Weiteren alternative Adsorptionsmatrizen und nicht-isokratische Prozesse untersucht werden.

Referenzen
[1] Genzel Y. et al.: Expert Rev. Vaccines 8, 1681 (2009)
[2] Wolff M. W. und Reichl, U.: Expert Reviews 10, 1451 (2011)
[3] Imamoglu S.: Adv. Biochem. Eng. Biot. 76, 211 (2002)
[4] Seidel-Morgenstern A. et al.: Chem. Eng. Technol. 31, 826 (2008)
[5] Gueorguieva L. et al.: J. Chromatogr. A 1135, 142 (2006)
[6] Mattiasson B. et al.: J. Chromatogr. B 877, 1651 (2009)
[7] Xie Y. et al.: Biotechnol. Prog. 18, 1332 (2002)
[8] Palani S. et al.: J. Chromatogr. A 1218, 6396 (2011)
[9] Kessler L. C. et al.: J. Chromatogr. A 1176, 69 (2007)
[10] Paredes G. et al.: Chem. Eng. Technol. 28, 1335 (2005)

Weitere Literatur ist bei den Autoren erhältlich.

Autoren
Tina Kröber, Michael W. Wolff, U. Reichl
Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme, Magdeburg, Deutschland
Otto-von-Guericke-Universität,
Lehrstuhl Bioprozesstechnik, Magdeburg, Deutschland

 

Kontaktieren

MPI für Dynamik Komplexer Technischer Systeme
Sandtorstr. 1
39106 Magdeburg

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