Naturstoffforschung: Die erfolgreiche Verbindung von Synthesechemie und Biotechnologie

  • Abb. 1: Strictosidin (3a) ist das Schlüsselintermediat der MIA-Biosynthese. Nach Einbringen der STR-Mutante V214M in C. roseus, wurden 5-modifizierte Tryptamin-Derivate (1b-d) akzeptiert und biosynthetisch prozessiert (verändert nach [4,5]).Abb. 1: Strictosidin (3a) ist das Schlüsselintermediat der MIA-Biosynthese. Nach Einbringen der STR-Mutante V214M in C. roseus, wurden 5-modifizierte Tryptamin-Derivate (1b-d) akzeptiert und biosynthetisch prozessiert (verändert nach [4,5]).
  • Abb. 1: Strictosidin (3a) ist das Schlüsselintermediat der MIA-Biosynthese. Nach Einbringen der STR-Mutante V214M in C. roseus, wurden 5-modifizierte Tryptamin-Derivate (1b-d) akzeptiert und biosynthetisch prozessiert (verändert nach [4,5]).

Die Nutzung von Naturstoffen für medizinische Anwendungen kann bis in die Jungsteinzeit hinein zurückdatiert werden. So wurde zum Beispiel schon früh Morphin aus Schlafmohn gewonnen und als Schmerzmittel verwendet. Bis heute behalten Naturstoffe ihre Relevanz in der Pharmazie entweder als aktive Wirkstoffe oder als Leitstrukturen [1].

Das kann darauf zurückgeführt werden, dass sie sich im Laufe der Evolution als effiziente „chemische Waffen“ einer Spezies gegen artfremde Organismen bewährt und somit einen Überlebensvorteil im jeweiligen Habitat gesichert haben. Naturstoffe besitzen also stets eine Bioaktivität, die auf die im natürlichen Kontext vorherrschenden Bedingungen hin optimiert ist. Für die Entwicklung neuer medizinisch anwendbarer Wirkstoffe ist es essentiell, die Strukturen von Naturstoffen weiter zu optimieren. Wegen deren Komplexität stellt die Herstellung der hierzu notwendigen Derivate ein zentrales Problem dar.

Bei Naturstoffen handelt es sich um die Produkte von in Organismengenomen codierten Biosynthesewegen. Generell wird in diesen durch schrittweises, Enzym-katalysiertes Zusammenfügen kleiner Bausteine, auf für jede Gruppe von Naturstoffen charakteristische Art und Weise, das Grundgerüst aufgebaut und individuell modifiziert. Hierdurch wird letztlich eine große Variabilität erreicht.

Traditionelle Zugänge zu Naturstoffen
Isolation aus natürlichen Quellen und Fermentation
Die Isolation von Naturstoffen aus natürlichen Quellen, wie zum Beispiel Pilzen oder Pflanzen, stellt einen naheliegenden Zugang dar. Dabei gibt es jedoch einen Haken: Bei Naturstoffen handelt es sich in der Regel um Sekundärmetabolite. Das bedeutet, dass diese nur in speziellen Situationen von einem Organismus produziert werden, wie beispielsweise zur Verteidigung gegen eine Infektion. Aus diesem Grund sind die Konzentration des gebildeten Naturstoffs im Extraktionsmaterial und folglich auch die finale Ausbeute meist gering. Bessere Ausbeuten sind oft erreichbar, wenn die Fermentation eines Naturstoffproduzenten unter kontrollierten Laborbedingungen gelingt. Allerdings können in beiden Fällen ausschließlich die Naturstoffe selbst und keine Derivate erhalten werden.

Totalsynthese
Der klassische Alternativansatz zur Isolation ist die chemische Totalsynthese.

Diese bietet große Freiheit wenn es darum geht, Derivate von Naturstoffen zu erhalten; jede Struktur ist prinzipiell zugänglich. Ein Beispiel für die beeindruckende Entwicklung dieser Disziplin stellt die Totalsynthese des Makrolid-Antibiotikums Erythromycin dar (Abb. 1 A). Woodward selbst äußerte sich im Jahr 1956 wenig optimistisch, was die Machbarkeit einer Erythromycin- Totalsynthese anging („Erythromycin, with all our advantages, looks at present quite hopelessly complex, particularly in view of its plethora of asymmetric centers”). Kurz nach Woodward‘s Ableben stellte seine Gruppe 1981 eine totalsynthetische Route zum Erythromycin A vor [2]. Diese umfasste 52 lineare Stufen bei einer Gesamtausbeute von 0,0089 %; aktuelle (formale) Totalsynthesen erreichen gar um ein Vielfaches höhere Gesamtausbeuten bei trotzdem deutlich geringeren Stufenzahlen [3].

Das Problem der Totalsynthese liegt aber klar auf der Hand: Je komplexer ein Naturstoff ist und je mehr synthetische Operationen benötigt werden, desto geringer wird die Endausbeute. Dem versucht der synthetische Chemiker entgegenzuwirken, indem er eine konvergente Syntheseroute mit einer minimalen Anzahl linearer Transformationen anstrebt.

Semisynthese und Vorläufer-dirigierte Biosynthese
Es wurden bereits früh Vorgehensweisen etabliert, die sich die Vorteile sowohl biologischer als auch chemischer Verfahren zu Eigen machen. So können durch Fermentation erhaltene Naturstoffe oder Biosyntheseintermediate chemisch derivatisiert werden (Semisynthese). Umgekehrt können veränderte Biosyntheseintermediate synthetisiert und an einen Naturstoffproduzenten verfüttert werden (Vorläufer-dirigierte Biosynthese). Wird der Vorläufer durch die Biosynthesemaschinerie akzeptiert, erhält man ein Gemisch des Naturstoffs und des gewünschten Derivates.

Auf beiden Wegen lässt sich die Effizienz einer Fermentation mit der Flexibilität eines Syntheseverfahrens verknüpfen. Leider ist aber in der Realität die durch beide Verfahren zugängliche Anzahl an Derivaten sehr begrenzt.

Neuartige Ansätze
Seit einigen Jahren ist es möglich, durch DNA-Sequenzierung die Gene von Biosynthesewegen zu analysieren. Deren Kenntnis kann unter Anwendung moderner gentechnischer Methoden für die Generierung von Naturstoff(derivat)en genutzt werden.

Kombinatorische Biosynthese
Durch Veränderung auf genetischer Ebene können die Biosynthesewege eines Produzenten direkt beeinflusst werden. So ist es möglich, Gene einzelner Enzyme und Domänen auszutauschen, auszulassen oder zusätzlich einzufügen (Kombinatorische Biosynthese). Dies führt im Erfolgsfall zu entsprechend modifizierten Naturstoffen. Mithilfe einzelner DNA-Basenaustausche (Punktmutagenese) können auch gezielt bestimmte Aminosäuren in Enzymen ersetzt und somit beispielsweise deren Substratspezifität verändert werden.

Heterologe Genexpression
Ebenfalls ist es möglich Biosynthesegene in einen artfremden Organismus einzubringen und zu exprimieren (Heterologe Genexpression).

Für synthetische Chemiker ist beispielsweise die Überexpression einzelner Biosynthesegene in leicht handhabbaren Organismen wie E. coli von Interesse. Die isolierten Enzyme können als hochselektive synthetische Werkzeuge eine Anwendung in der Organischen Chemie finden (Biokatalyse). Weiterhin ist auch die Einbringung und Expression der Gene kompletter Biosynthesewege in Fremdorganismen möglich. Dies kann die Verbesserung der Naturstoffproduktion oder das „Aufwecken“ zuvor abgeschalteter Gene bewirken.

Mutasynthese
Bei einer Mutasynthese werden alternative synthetische Start- oder Verlängerungsbausteine an einen Produktionsstamm verfüttert und die veränderten Biosyntheseprodukte anschließend aus dem Kulturmedium extrahiert. Im Unterschied zur Vorläuferdirigierten Biosynthese werden die nativen Bausteine nicht mehr eingebaut, da die für deren Synthese verantwortlichen Gene im Produzenten abgeschaltet wurden (Blockmutante). Dadurch sind Derivate in besserer Ausbeute und größerer Reinheit zugänglich.

Beispiele
5-Substituierte Strictosidine
Im Gegensatz zu Mikroorganismen ist bei Pflanzen das Verständnis für Mechanismen und Regulation der Biosynthesewege noch recht eingeschränkt. Bemerkenswert ist daher die Arbeit der Gruppe O’Connor [4].

Bei der Monoterpen-Indol-Alkaloid- (MIA)-Biosynthese in Zimmerimmergrün (Catharantus roseus) lassen sich eine Reihe von interessanten bioaktiven Alkaloiden (wie zum Beispiel Ajmalicin (6a) und Catharanthin (7a) auf den gemeinsamen Vorläufer Strictosidin (3a) zurückführen. Dieser wird in einer Pictet-Spengler-Reaktion durch das Enzym Strictosidin-Synthase (STR) aus Secologanin (2) und Tryptamin (1a) gebildet (Abb. 1).

Im Vorfeld war bereits bekannt, dass die STR nur geringfügige Veränderungen der Substrate akzeptiert und dass sie daher den Flaschenhals dieses Biosyntheseweges repräsentiert. Mithilfe gezielter mutagenetischer Veränderung des Wildtyps wurde eine STR-Variante mit größerer Substrattoleranz erhalten. In einer Wurzelkultur wurde das Wildtypgen gegen das Gen der STR-Variante ausgetauscht. In erneuten Fütterungsexperimenten akzeptierte die resultierende Mutante die alternativen Tryptamine 1b, 1c und 1d, die vom Wildtypstamm nicht in die Biosynthese aufgenommen worden waren. Die erwarteten funktionellen Gruppen fanden sich in den gebildeten „unnatürlichen“ Alkaloiden 6b, 6c und 6d wieder. Hier wurden neue Derivate durch Punktmutagenese ermöglicht.

Fluorosalinosporamid
Salinosporamid A (9) ist ein chlorierter Naturstoff, der von dem Meeresbakterium Salinispora tropica produziert wird (Abb. 2) [6]. Es wird als Proteasominhibitor zurzeit für die Behandlung multipler Myeloma und anderer Krebsarten eingesetzt. Weil alternative Halogenierung häufig die biologische Aktivität erhöht, sollten für Testungen entsprechende Salinosporamid-Analoga hergestellt werden. Das Bromo-Derivat wurde durch simplen Austausch des Meerwassers im Kulturmedium durch eine Natriumbromid- Lösung erhalten. Iodosalinosporamid konnte semisynthetisch aus Salinosporamid A hergestellt werden. Für Fluorosalinosporamid (11) waren beide Strategien hingegen nicht zielführend.

Stattdessen wurde das Gen für die Chlorinase SalL im Genom von S. tropica ausgeschaltet, um die Bildung des chlorierten Bausteins 5‘-Chloro-5‘-desoxyadenosin (8) zu unterbinden (Abb. 2). Nach Zugabe von 5‘-Fluoro-5‘-desoxyadenosin (10) zu einer Zellkultur dieser Mutante wurde statt des 4-Chlorobutanoats das entsprechende 4-Fluorobutanoat eingebaut und Fluorosalinosporamid (11) erhalten. Wenn auch erfolgreich, handelt es sich um ein eher exotisches Beispiel einer Mutasynthese, da hier kein Startbaustein, sondern der Vorläufer einer Verlängerungseinheit zugefüttert und in den Naturstoff eingebaut wurde.

Alkylierte Erythromycine
Die Erythromycin-Biosynthese ist sehr gut untersucht und es bestehen daher gute Erfolgsaussichten, durch genetische Veränderungen neue Derivate zu erhalten. Erythromycin (12) wird von einer Polyketidsynthase des Typs I (PKS-I) gebildet. Einzelne Module der PKS verlängern dabei ein wachsendes Rückgrat um jeweils 2 Kohlenstoffatome wobei charakteristische Domänen die einzelnen Teilschritte katalysieren. Mittels Veränderung oder Austausch einzelner Domänen kann beispielsweise der Oxidationszustand oder das Substitutionsmuster des Polyketidrückgrates verändert werden (Abb. 3 A) [7].

Die Gruppe um Leadlay und Staunton tauschte die Acyltransferase (AT)-Domäne im Lademodul der Erythromycin-PKS gegen die analoge AT aus der Avermectin-Biosynthese aus. Die resultierende Mutante war in der Lage, zusätzlich Erythromycin-Derivate 16a und 16b zu produzieren, die am C-13 statt einer Ethylgruppe Avermectin-charakteristische Isopropyl- oder Isobutylgruppen trugen (Abb. 3 B) [8].

Es wird deutlich, dass auf diese Weise der Zugang zu bestimmten Erythromycin-Derivaten wesentlich effizienter erreichbar ist als über die Totalsynthese.

Zusammenfassung
Fortschritte im Bereich der DNA-Sequenziertechniken haben einem tieferen Verständnis von Biosynthesewegen komplexer Sekundärmetabolite und der Entwicklung neuartiger Ansätze zur Produktion von Naturstoff(derivate)en den Weg bereitet. Vor allem in der Verknüpfung mit der flexiblen synthetischen Chemie liegt großes Potential für die zukünftige Entwicklung neuer, vom Vorbild der Natur abgeschauter Wirkstoffe.

Referenzen
[1] Kirschning A. und Hahn F.: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 4012 - 4022 (2012)
[2] a) Woodward R. B. et al.: J. Am. Chem. Soc. 103, 3210 - 3213 (1981) b) Woodward R. B. et al.: J. Am. Chem. Soc. , 103, 3213 - 3215 (1981) c) Woodward R. B. et al.: J. Am. Chem. Soc. 103, 3215 - 3217 (1981)
[3] Muri D. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 44, 4036 - 4038 (2005)
[4] Runguphan W. und O’Connor S. E.: Nat. Chem. Biol. 5, 151 - 153 (2009)
[5] Molecular Biomethods Handbook (Hrsg: J. M. Walker & R. Rapley), Hertfordshire, Humana Press, 2008, 875 - 904, ISBN 978 - 1 - 60327 - 370 – 1.
[6] Eustáquio A. S. und Moore B. S.: Angew. Chem. Int. Ed. 47, 3936 - 3938 (2008)
[7] Park S. R. et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1227 - 1239 (2010)
[8] Marsden A. F. et al.: Science 279, 199-202 (1998)

 

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Wirkstoffforschung
Classics in Total Synthesis I, II & III : http://bit.ly/Nicolaou

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