Neuerungen in der Spurenelementanalytik

Hochsensitive Verfahren mit möglicher Relevanz für die Pharmazeutische Analytik

  • Abb. 1: Schematischer Aufbau eines HR-CS AAS (angelehnt an [3] und [4])Abb. 1: Schematischer Aufbau eines HR-CS AAS (angelehnt an [3] und [4])
  • Abb. 1: Schematischer Aufbau eines HR-CS AAS (angelehnt an [3] und [4])
  • Abb. 2: beispielhaftes HR-CS AAS „3D“ Signal: Titan (1.5 ppm) in einer Zellsuspension. Die Messung erfolgte mit einem ContrAA 700 HR-CS AAS von Analytik Jena.

Die (Bio)analytik von Metallen und Metallverbindungen stellt eine analytische Herausforderung für den Anwender in der Forschung und in der pharmazeutischen Industrie dar. Insbesondere in der Arzneistoffentwicklung werden Verfahren benötigt, die eine Bestimmung in biologischem Material ermöglichen. Dieser Beitrag gibt eine kurze Einführung in den Bereich der Schwermetallanalytik und stellt ausgewählte instrumentelle Neuerungen vor.

Seit vielen Jahren ist die quantitative Bestimmung von Metallverunreinigungen in pharmazeutischen Zubereitungen ein wichtiges Kriterium in der Qualitätskontrolle von Arzneimittelherstellern. Doch nicht nur für die pharmazeutische Industrie ist die empfindliche Erfassung von Metallen ein wichtiges Verfahren, auch in der Forschung auf dem Gebiet neuer Metallotherapeutika ist eine genaue und zuverlässige Quantifizierung von Metallen insbesondere in biologischem Material notwendig. Mithilfe instrumenteller Analysemethoden kann die Bioverteilung von Metallkomplexen, die eine wichtige Information für die Optimierung neuer potentieller Arzneistoffe darstellt, untersucht werden. Ein neues, seit einigen Jahren ständig wachsendes Forschungsgebiet ist die interdisziplinäre Wissenschaft Metallomics (angelehnt an Genomics oder Proteomics), die sich mit der biologischen Untersuchung von Spurenmetallen beschäftigt [1]. Pharmazeutische Industrie und Forschung nutzen hochselektive und -sensitive Analyseverfahren zur Metallquantifizierung und machen die Notwendigkeit für eine Weiterentwicklung der verfügbaren instrumentellen Methoden deutlich. Zu Quantifizierungszwecken werden sehr leistungsfähige instrumentelle Analyseverfahren, wie Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) aufgrund ihrer hohen Selektivität und geringen Nachweisgrenzen eingesetzt. Während die AAS sich bereits in vielen analytischen Laboren als ein schnelles und zuverlässiges Verfahren in der Spurenmetallanalyse etabliert hat, gewinnt die ICP-MS aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit zunehmende Beliebtheit nicht nur in wissenschaftlichen Bereichen sondern auch vermehrt in der industriellen Analytik [2]. Aktuell gibt es einige technische Neuerungen auf dem Gebiet der qualitativen und quantitativen Bioanalytik von Metallen, wobei die hochauflösende Atomabsorptionsspektrometrie mit Kontinuumstrahler (engl.

high-resolution continuum source AAS, HR-CS AAS) als eine AAS-Methode mit verbesserter simultaner Untergrundkorrektur und die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzanalyse (engl. total reflection X-ray spectroscopy, TXRF), die eine simultane Multielementanalytik ermöglicht, in diesem Beitrag beispielhaft thematisiert werden.

AAS mit Kontinuumstrahler
Das Messprinzip der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) beruht darauf, dass im Grundzustand vorliegende Atome Strahlung bei charakteristischen Wellenlängen absorbieren können. Die gemessene Absorption korreliert mit der Konzentration des entsprechenden Elements in der Probe. Für die Überführung eines Atoms in den gasförmigen Zustand werden zunächst die Lösungsmittel und leichtflüchtigen Bestandteile durch Erhitzen entfernt, anschließend werden die freien Atome durch Erhitzen auf Temperaturen bis zu 3000 °C atomisiert. Für die Atomisierung kommen vorwiegend Flammen oder Graphitrohröfen zum Einsatz. Bei der Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie (F-AAS) wird eine flüssige Probe zunächst in ein Aerosol überführt und in eine Flamme zerstäubt, in der die Probe letztendlich atomisiert wird. Die Flamme wird üblicherweise mit einem Luft-Acetylen-Gemisch betrieben. Mittels F-AAS können Metallkonzentrationen im unteren mg / L-Bereich zufriedenstellend quantifiziert werden. Die Graphitofen-Atomabsorptionsspektroskopie (GF-AAS), auch als Atomabsorptionsspektrometrie mit elektrothermischer Aufheizung (ET-AAS) bezeichnet, ist mit Nachweisgrenzen im unteren μg/LBereich empfindlicher als die F-AAS. Bei der GF-AAS wird die Probe durch ein schmales Loch in das im Ofen befindliche Graphitrohr injiziert. Nach Ablauf eines Ofenprogrammes wird nach erfolgter Atomisierung die Absorption über die Zeit gemessen. Bei der traditionellen AAS werden Hohlkathodenlampen mit dem zu quantifizierenden Element als Kathode oder elektrodenlose Entladungslampen als Strahlungsquellen zur Anregung verwendet. Eine instrumentelle Neuerung ist die eingangs erwähnte high-resolution continuum-source AAS (HR-CS AAS), die mit einem CCD-Detektor und einer Xenonkurzbogenlampe als kontinuierliche Strahlungsquelle ausgestattet ist (Abb. 1) [3 – 6]. Dies ermöglicht die Verwendung der Wellenlänge als dritte Dimension neben Absorption und Zeit, womit nicht nur eine bestimmte Wellenlänge sondern ein spektraler Bereich zur Messung eingesetzt werden kann (Abb. 2). Dadurch können letztendlich mehr Informationen über die spektrale Umgebung abseits des Analytensignals erhalten werden. Folglich können die Messdaten besser hinsichtlich spektraler Interferenzen (z. B. aufgrund von anderen Elementlinien in der näheren spektralen Umgebung) oder Matrixeffekten von biologischem Material, korrigiert werden [3, 4]. Des Weiteren wird die Handhabung bei Routinemessungen erleichtert, da kein Wechseln der Hohlkathodenlampen zwischen der Messung unterschiedlicher Elemente erforderlich ist. Der spektrale Bereich, welcher mit HR-CS AAS aufgelöst werden kann, beträgt derzeit nur Bruchteile eines Nanometers. Das Verfahren ist somit noch nicht ausreichend zur simultanen Multielementanalytik einsetzbar, sein besonderer Vorteil gegenüber der konventionellen AAS besteht in der erwähnten deutlich verbesserten Untergrundkorrektur. Eine AAS-Methode, die seit Entwicklung der HR-CS AAS ihre Renaissance erlebt, ist die direkte Feststoffanalytik (engl. solid sample analysis) mittels GF-AAS (SS-GFAAS). Die Methodenentwicklung auf dem Gebiet der direkten Feststoffanalytik wurde durch die Sichtbarkeit der spektralen Umgebung neben der Analysenlinie, der damit verbundenen Erkennung spektraler Störungen sowie die verbesserte Untergrundkorrektur vereinfacht, so dass viele Elemente seit wenigen Jahren zuverlässig und ohne vorherige Probenaufbereitung als Feststoff direkt quantifiziert werden können [5].

Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzspektroskopie
Methoden der Röntgenfluoreszenzspektroskopie nutzen einen energiereichen Röntgenstrahl zur Anregung der Probe. Dies führt zur Anregung und Herausschlagen von Elektronen in den inneren kernnahen Schalen (K, L oder M) des Atomkerns. Dadurch können Elektronen aus den äußeren Schalen unter Emission von (Röntgen)fluoreszenzstrahlung auf ein niedrigeres Energieniveau wechseln. Die emittierten Linien entsprechen diversen Elektronenübergängen der jeweiligen Elemente. Röntgenfluoreszenzspektroskopie wird in den Materialwissenschaften vielfach zur qualitativen und quantitativen Analyse der Elementzusammensetzung genutzt. Die Anwendung in der Spurenanalytik und bei biologischen Proben war bisher jedoch aufgrund von Matrixeffekten und fehlender Empfindlichkeit nur sehr begrenzt möglich.

Bei der Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzspektroskopie (engl. total reflection X-ray spectroscopy, TXRF) werden die Röntgenstrahlen in einem sehr flachen Winkel auf eine Probe, die in Form einer dünnen Schicht auf einen Objektträger aufgetragen wurde, eingestrahlt und totalreflektiert [7]. Der Röntgenstrahl tritt dabei primär nur mit der Oberfläche in Wechselwirkung und löst dort die elementspezifische Fluoreszenzemission aus. Dies ermöglicht die sensitive und selektive Detektion der meisten Elemente ab Fluor. Die Methode verspricht Nachweisgrenzen im Spurenbereich sowie die Möglichkeit der simultanen Bestimmung einer Vielzahl von Elementen in einer einzigen Messung. Die Proben werden in der Regel durch Zusetzen eines internen Standards analysiert. Für den Analytiker ist die Aufbringung der flüssigen oder festen biologischen Probe in einer sehr dünnen (max. 15 μm) Schicht auf den Träger ein entscheidender Schritt in der Probenvorbereitung. Dabei ist insbesondere die Homogenität des Probenmaterials zu beachten. Die Auswirkung verschiedener Parameter der Probenvorbereitung (z. B. Art der Probentrocknung, Einsatz von Detergenzien) ist noch Gegenstand laufender Forschungsarbeiten. Die Anwendung der TXRF auf eine Vielzahl von biologischen Proben ist bereits beschrieben [8]. So wurden unter anderem Zellmaterial, Serum, Blut, Urin oder Gewebeproben mittels TXRF auf das Vorhandensein und den Gehalt unterschiedlicher Elemente untersucht. Besondere Bedeutung könnte die TXRF Spektroskopie auch in der pharmazeutischen Analytik erlangen. In der Qualitätskontrolle spielen aus Zeit- und Kostengründen neben der Empfindlichkeit unter anderem auch die Möglichkeit einer sehr vereinfachten Probenvorbereitung mit wenigen Arbeitsschritten sowie die Bedienerfreundlichkeit eine wichtige Rolle. Aktuelle Veröffentlichungen thematisieren inzwischen die Einsatzmöglichkeiten der TXRF in der pharmazeutischen Rückstandsanalytik [9,10].

Schlussfolgerung
Mit der HR-CS AAS steht ein AAS Verfahren mit verbesserter Untergrundkorrektur und mit der TXRF eine Methode, die eine stark vereinfachte Probenvorbereitung ermöglichen könnte, zur Verfügung. Ob sich die beiden Verfahren im Routinebetrieb in der quantitativen pharmazeutischen Analytik von Metallen im Spurenbereich gegen etablierte Methoden wie konventionelle AAS oder ICP-MS durchsetzen, wird sich in der nahen Zukunft herausstellen.

Literatur bei den Autoren erhältlich.

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