Peptidbinder für Targetproteine

Kombination von zwei verschiedenen Techniken

  • Abb. 1: CIS display. Auffinden von Peptidbindern mit Hilfe von CIS displayAbb. 1: CIS display. Auffinden von Peptidbindern mit Hilfe von CIS display
  • Abb. 1: CIS display. Auffinden von Peptidbindern mit Hilfe von CIS display
  • Abb. 2: Partikel-basierte Synthese von Peptidarrays. Kombinatorische Synthese eines Peptidarrays mit einem Laserdrucker.
  • Abb. 3: Peptidarray zur Validierung der mit CIS display gefundenen Peptide. 20.000 Peptide (Triplikate) aus dem vorgeschalteten CIS display screen wurden mit Fluoreszenz- markiertem TNFa (rot) und mit Kontrollprotein (grün) gefärbt. Zu sehen ist außerdem ein Rahmen von HA- und Flag-Kontrollpeptiden.

Im Rahmen eines von der EU geförderten Projektes konnte gezeigt werden, dass durch die Kombination von zwei verschiedenen Techniken in einem einfachen Verfahren Peptidbinder für ein Tumortarget gefunden werden können. Diese Peptidbinder können in nachfolgenden Schritten z. B. als Leitstrukturen zur Entwicklung neuer Therapeutika dienen.

Lebensprozesse werden durch die regulierte Bindung zwischen Molekülen gesteuert, z.B. entscheidet das Anheften einer Phosphorylgruppe an kurze Proteinbereiche durch eine Sequenz-spezifische Kinase, ob eine bestimmte SH2 Domäne ein Protein mit dieser Aminosäuresequenz bindet oder nicht [1]. Analog zu den logischen Verknüpfungen kann eine Zelle so als Antwort auf einen Input (welche Kinase wird gerade aktiviert) einen einprogrammierten Output liefern (welche Proteine liegen vor, die durch den Input beeinflusst werden), indem eine oder mehrere von etwa zwei Dutzend bekannten Signalketten durch die Aktivität dieser Kinase ein- oder ausgeschaltet werden.

Die Grundlagenforschung will dabei z. B. wissen welche Enzyme welche Bereiche auf den Zielproteinen verändern und welche Proteine oder Gensegmente daraufhin gebunden oder nicht mehr erkannt werden. Aber auch die Pharmaindustrie hat großes Interesse an ganz ähnlichen Fragestellungen, z. B. bindet der Wirkstoff Imatinib (Handelsname Glivec) an die Tyrosinkinase ABL, die bei Krebspatienten mit Chronischer Myeloischer Leukämie (CML) abnormal aktiviert wurde und unterbricht dadurch die von ABL ausgehende Signalkette, die ansonsten zu unkontrolliertem Zellwachstum führt [2]. Ein anderes Beispiel sind die Statine, die an die HMG-CoA-Reduktase binden und so die Synthese von Cholesterin verlangsamen, wodurch das Risiko eines Herzinfarktes deutlich sinkt [3].

Aus diesem Grund investiert die Pharmaindustrie große Geldsummen um sogenannte small compound libraries aufzubauen, die dazu dienen nach Bindern zu suchen, die einen Signalweg oder auch ein Enzym in der gewünschten Weise beeinflussen. Allerdings sind diese small compound libraries sehr teuer in der Herstellung, Pflege und auch bei der Suche nach Bindern - man schätzt, dass bei einem Screening nach Bindern pro Molekül Kosten von etwa 1 € entstehen.

Ein weiterer Nachteil ist, dass zunächst gefundene Binder (die Leitstruktur) sehr aufwändig modifiziert werden müssen, um bessere oder auch ggf. stabilere Binder in nachfolgenden Screeningrunden zu finden.

Im Rahmen des EU FP7 Projektes „Targetbinder" (siehe Crossmediabalken) wurde die Frage gestellt, ob durch die Kombination zweier unterschiedlicher Techniken zur Herstellung von Peptid-basierten Molekülbibliotheken Peptidbinder für interessante Targetproteine schneller, günstiger und standardisierbar, ohne Vorinformation gefunden werden können. Einmal gefundene schwache Binder können ohne großen Aufwand in ihrer Aminosäuresequenz verändert und auf eine bessere Bindung getestet werden. Diese könnten dann, wie small compound libraries, als Leitstrukturen für die Entwicklung von Therapeutika dienen.

Peptid-display Methoden
1985 hat George P. Smith eine einfache Methode erfunden, mit der 109 bis 1011 verschiedene Peptide hergestellt werden können. Dabei werden kleine Peptid-codierende DNA-Segmente mit dem Gen für ein Hüllprotein eines Bakteriophagen fusioniert, sodass jeder Bakteriophage „sein" Peptid auf der Oberfläche präsentiert. Da derselbe Phage gleich auch noch das entsprechende Gensegment verpackt, können so mittels PCR und anschließender Sequenzierung die gebundenen Peptide ausgelesen werden [4]. Noch deutlich mehr Peptide kann man herstellen, wenn die Peptide durch in vitro Translation im Reagenzglas erzeugt werden, denn dann codiert nahezu jedes mRNA Fragment ein unterschiedliches Peptid. Um diese riesige Zahl von Peptiden nach spezifischen Bindern durchsuchen zu können, muss allerdings das synthetisierte Peptid mit dem Ribosom sowie der Peptid-codierenden RNA physisch verbunden bleiben, denn nur dann können wie beim phage display die gebundenen Peptide mittels PCR und Sequenzierung bestimmt werden [5, 6].

CIS display Technik
Bei der verwendeten Technik bleiben die im Reagenzglas hergestellten bis zu 1014 unterschiedlichen Peptide mit der sie codierenden DNA verbunden (Abb. 1). Analog zu dem oben beschriebenen Phagenhüllprotein werden hier die unterschiedlichen Peptide an das Protein RepA fusioniert, das nach seiner Synthese durch das Ribosom sequenzspezifisch an genau die dsDNA bindet, die auch für das daran fusionierte Peptid codiert [7]. Ein Nachteil dieser Methode ist aber, dass viele Peptide auch an Komponenten des Suchsystems, oder unspezifisch binden. Deshalb wird eine weitere Technologie benötigt, um gefundene Binder zu validieren und ggf. in ihren Bindungseigenschaften zu verbessern.

Peptidsynthesemethoden
Die heute im Wesentlichen noch unverändert durchgeführte Festphasensynthese von Peptiden ist von Bruce Merrifield erfunden worden, der dafür 1984 den Nobelpreis bekommen hat [8]. Er kuppelte die wachsende Peptidkette an eine feste Trägeroberfläche, wodurch nicht abreagierte Aminosäuren sehr einfach weggewaschen werden können. Noch wichtiger ist dabei, dass diese Methode sehr einfach ermöglicht bei jedem Kupplungsschritt einen großen Überschuss an Aminosäure-Bausteinen anzubieten, sodass ein sehr großer Teil der wachsenden Peptidkette auch tatsächlich um eine weitere Aminosäure verlängert wird. Ronald Frank wiederum hatte die Idee, die 20 verschiedenen aktivierten Aminosäure-Bausteine einfach in einem geeigneten Lösungsmittel kombinatorisch auf unterschiedliche Bereiche eines festen Trägers aufzutupfen, womit die ersten Peptidarrays entstanden [9].

Partikel basierte Synthese von Peptidarrays
Eine Variante der Grundidee von Ronald Frank wird derzeit am Karlsruher Institut für Technologie weiterentwickelt. Die Aminosäure-Bausteine werden dabei nicht in gelöster Form auf die Syntheseorte getupft, wo sie verlaufen können und kleine Lösungsmittelmengen sofort verdunsten, sondern sie werden in feste elektrisch aufladbare „Aminosäurepartikel" eingebettet bevor sie z.B. mit einem Laserdrucker [10] oder mit Hilfe der Pixelelektroden eines Computerchips [11] an die Syntheseorte verschickt werden [12]. Anschließend werden die Partikel auf dem Träger geschmolzen und so die darin eingeschlossenen Fmoc-geschützten aktivierten Aminosäuren freigesetzt (Abb. 2). Erst in diesem Moment wird die Kupplung an den Träger oder an das bereits synthetisierte Peptid gestartet. Die Partikel stellen somit eine stabile Transportform für die Aminosäure-Bausteine dar und liefern darüber hinaus den Reaktionsraum für die chemische Umsetzung am Bestimmungsort, der sehr stark miniaturisiert werden kann. Die Anzahl der nacheinander auszuführenden Druckvorgänge ergibt sich dabei aus der Zahl von Aminosäureresten, welche die fertigen Peptide enthalten sollen.

Ergebnisse und Ausblick
Erste Ergebnisse zeigen, dass es tatsächlich möglich ist auch ganz ohne Vorinformationen Peptid-basierte Binder gegen interessante Targetproteine zu finden. Zunächst wurde die in Abbildung 1 beschriebene Technik eingesetzt, um aus einer Bibliothek von etwa 1014 verschiedenen Peptiden diejenigen anzureichern, die an TNFα gebunden haben. Danach wurden die Peptid-codierenden Sequenzen der so angereicherten Peptid-RNA-DNA-Komplexe mit Hilfe von PCR und einem Illumina Sequencer ausgelesen. Anschließend wurden diese Peptide mit dem in Abbildung 2 beschriebenen Verfahren als Triplespots im Arrayformat hergestellt und mit Fluoreszenz-markiertem TNFα sowie einem Kontrollprotein angefärbt (Abb. 3). Dabei ist klar zu sehen, dass einige der mit CIS display identifizierten Peptide tatsächlich spezifisch an TNFα gebunden haben. Die so validierten Peptidbinder können anschließend systematisch in ihrer Aminosäuresequenz variiert werden, um so bessere Binder zu finden. Diese vorläufigen Ergebnisse wollen die beteiligten Gruppen zu einem standardisierten, rel. kostengünstigen und schnellen Screeningverfahren weiter entwickeln, wobei von besonderem Interesse ist, ob dieses Verfahren auch bei anderen Targetproteinen spezifisch bindende Peptide ergibt.

Autoren:
Bastian Münster 1, Christopher Brankin 4, Diego Yepes 2, Volker Stadler 3, Thomas Felgenhauer 3, Chris Ullman 4, Neil Cooley 4, Alexander Nesterov-Müller 1, F. Ralf Bischoff 2, Frank Breitling 1

1 Karlsruher Institut für Technologie (KIT),
Institut für Mikrostrukturtechnik (IMT)
2 Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
3 Pep per Print , Heidelberg
4 Isogenica, Großbritannien

Weiterer Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Analyse-NGS
Mehr Informationen zum Thema: http://bit.ly/Targetbinder ; http://bit.ly/Peptidbinder
Webcast zum 2. Generation Sequencing: http://bit.ly/GIT-NGS

 

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Karlsruhe Insitute of Technology
Hermann-von-Helmholzplatz 1
76344 Eggenstein-Leopoldshafen
Germany

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