Quantifizierung von Biomarkern

Computergestützte Bildanalyse von IHC Präparaten

  • Abb. 2: Messung der Intensität eine nukleären Markers mittels Histoquest Software. A Die Auswahl von 4 Regionen von Interesse (regions of interest, ROI) in einem Leberpräparat, das mit einem Antikörper gegen Stat5 (braun) gefärbt wurde. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin Färbung (blau) sichtbar gemacht . B Die Zellerkennung beruht auf der Hämatoxylin Färbung und der Etablierung einer nukleären Maske (rote Linie). Rechts sind Scattergramme der Hämatoxylin/Stat5 gefärbten Zellen dargestellt.Abb. 2: Messung der Intensität eine nukleären Markers mittels Histoquest Software. A Die Auswahl von 4 Regionen von Interesse (regions of interest, ROI) in einem Leberpräparat, das mit einem Antikörper gegen Stat5 (braun) gefärbt wurde. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin Färbung (blau) sichtbar gemacht . B Die Zellerkennung beruht auf der Hämatoxylin Färbung und der Etablierung einer nukleären Maske (rote Linie). Rechts sind Scattergramme der Hämatoxylin/Stat5 gefärbten Zellen dargestellt.
  • Abb. 2: Messung der Intensität eine nukleären Markers mittels Histoquest Software. A Die Auswahl von 4 Regionen von Interesse (regions of interest, ROI) in einem Leberpräparat, das mit einem Antikörper gegen Stat5 (braun) gefärbt wurde. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin Färbung (blau) sichtbar gemacht . B Die Zellerkennung beruht auf der Hämatoxylin Färbung und der Etablierung einer nukleären Maske (rote Linie). Rechts sind Scattergramme der Hämatoxylin/Stat5 gefärbten Zellen dargestellt.
  • Abb. 3: Quantifizierung von Immunfluoreszenzen. A Beispiel einer Dreifachfärbung humaner Haut welche mit einer anti-Plakoglobin (grün), einem anti-Ki- 67-Antikörper (rot) sowie DAPI (blau) als Kernmarker gefärbt wurde. Ziel der Analyse war es, den Anteil der Ki-67-positiven Keratinozyten herauszufinden. B, C Nukleäre Fragmentierung aufgrund der DAPI Färbung und Erstellung der Kernmaske. D Erstellung der Zellulären Maske mit Hilfe des “Grew in Stained Area” Algorithmus. Diese so erzeugten Maske entsprechen genau der unregelmäßigen Form der Plakoglobin positiven epidermalen Keratinozyten. E Die Integration der Ki67 Detektion in die Zellmaske aus D identifiziert Ki-67 positive Keratinozyten. F Schließlich werden im Scatterdiagramm alle Objekte auf der Grundlage des Ergebnisses der Analyse und der Intensität der Ki-67 Färbung auf der y-Achse und der Intensität für Plakoglobin auf der x-Achse dargestellt. Die dargestellten Dots in Grün sind die Objekte, die doppelt positiv waren, und können unter Verwendung “backward” Funktion nachgewiesen und zurückverfolgt werden (siehe E, rot begrenzte Kerne).

Die enormen Fortschritte im Verständnis der molekularen Biologie von malignen Erkrankungen und das Vorliegen der vollständigen Sequenz des humanen Genoms zeigen Einblicke in molekulare Signalwege, die essentiell für die Krebsentstehung und Progression sind [1]. Die Blockade von Schlüsselmolekülen, die für diese Signalwege verantwortlich sind, sind ein zentrales Thema in der modernen zielgerichteten Krebsbehandlung.

Einige dieser Medikamente sind sehr erfolgreich; wie zum Beispiel der BCR-Abl Kinase-Inhibitor Imatinib, der die chronisch myeloische Leukämie (CML) [2], eine überwiegend monogenetisch getriebene Erkrankung von einer unheilbaren zu einer heilbaren Erkrankung machte. Ein weiteres Beispiel sind die Inhibitoren des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (HER-2), die verwendet werden, um Krebspatienten zu behandeln, die eine fehlerhafte Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) in den Tumorzellen zeigen [3]. Die immunhistochemische (IHC) Evaluierung der deregulierten Moleküle ist ein integraler Bestandteil der Diagnose und Überwachung der Behandlung von Tumoren. Darüberhinaus ist die Analyse dieser Biomarker essentiell für die Wahl der geeignetsten Therapien. Eine zielgerichtete Therapie macht nur unter der Voraussetzung Sinn, dass nicht weitere Mutationen im selben Signalweg vorhanden sind. Dies zeigt die Wichtigkeit der IHC Analyse in der Tumordiagnostik und Therapieplanung. Zusätzlich ist anzumerken, dass maßgeschneiderte Behandlungen immer teurer werden und somit stellt eine genaue Biomarker Quantifizierung auch einen kritischen Wirtschaftsfaktor dar.

Manuelle Auswertung von IHC Präparaten
Die manuelle Auswertung der IHC gefärbten Tumorproben ist eine subjektive und sehr individuelle Aufgabe, die leider eine hohe Intra-und Inter-Observer-Variabilität aufweist. Eine Studie mit einer großen Gruppe von Evaluatoren hat gezeigt, dass 24% einer Östrogen-Rezeptor (ER)-Färbung bei Brustkrebs Patientinnen Proben falsch negativ beurteilt wurden [4]. Abbildung 1 veranschaulicht deutlich mit welchen visuellen Problemen man beim Befunden von Farbintensitäten zu kämpfen hat, da das menschliche Auge/Gehirn eine Farbintensität immer relativ zur Umgebung abschätzt.

Hinzu kommt noch eine beträchtliche Varianz zwischen der Wahrnehmung zweier Pathologen und bekanntlich auch die tagesverfassungsabhängige Varianz, wie oben bereits erwähnt. Die dynamische Art der Erkennung von Objektunterschieden hilft uns im täglichen Leben Strukturen noch wahrzunehmen, die bei linearer Erkennung kaum mehr auszunehmen wären. Bei der Beurteilung der Spezifität einer Färbung ist das von Vorteil da auch die Einbeziehung von Mustern und Konturen von Bedeutung sind. Im Falle der Abschätzung von Farbintensitäten kommt diese Fähigkeit aber nicht zu tragen (siehe Beispiel) und eine Einteilung in bestimmte vordefinierte Standardgruppen (-, +,++, +++) ist zwar weit verbreitet aber subjektiv und von vielen Variablen abhängig. Hinzu kommt, dass bestimmte Färbungen (z.B. Brauntöne bei DAB Färbungen) in allen erdenklichen Mischungen mit anderen Farben (z.B. Blau bei Hematoxylin Färbung der Kerne) vorliegen und ein starkes Blau ein schwaches Braun für das menschliche Auge/Gehirn überlagern kann. Es liegt also auf der Hand, dass eine Unterstützung mittels digitaler Bildanalyse hilfreich ist zumal es Algorithmen gibt, die diese Farbtrennung reproduzierbar durchführen. 

Eine maßgeschneiderte Behandlungsstrategie in der Klinik steht und fällt daher mit der exakten Beurteilung und Quantifizierung der Biomarker-Expression. Für die Behandlung ist es essentiell, exakte Expressionsniveaus aus den Krebsproben der Patienten zu bestimmen, und genügt nicht, rein qualitative Informationen zu erhalten, ob ein bestimmter Biomarker vorhanden ist oder nicht [5, 6]. Darüber hinaus ist es von großer Bedeutung zu wissen, in welchem Zelltyp (Stroma-oder Tumorzelle) eine verstärkte / verminderte Expression eines bestimmten Biomarkers nachweisbar ist.

Computergesteuerte Bildanalyse von IHC Präparaten
Studien haben gezeigt, dass die computergestützte Bildanalyse von IHC gefärbten Proben eine valide, verlässliche und kostengünstige Lösung sein könnte. Unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen ist diese Methode der manuellen Auswertung deutlich überlegen. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation konnten unsere Arbeitsgruppen zeigen, dass die automatisierte Bildanalyse in der Lage ist auch sehr feine Unterschiede in der Proteinexpression zu unterscheiden [7].

Wir verwenden die Plattform Tissuefaxs (Tissuegnostics), die vollautomatisiert gefärbte histologische Präparate einscannt und mittels der Software namens Histoquest für IHC Analysen bzw Tissuequest für Immunfluoreszenzfärbungen quantifiziert. Diese Bildanalysesoftwares sind vergleichbar mit der Durchflusszytometrie. Alle zu messenden Objekte (Zellen) werden zuerst mittels eines Kernerkennungsalgorithmus definiert. Dies passiert über einen sogenannten Master-Kanal der entweder Hämtoxoxylin (IHC) oder DAPI (IF) als Kernfärbung verwendet. Alle erkannten Zellkerne werden mit einer dünne Linie umgeben (Abb. 2) Nach dieser Identifikationsphase erfolgt der Messschritt und der Benutzer muss spezifizieren, wo er die Farbintensität messen möchte. Im Falle von Kernfärbungen (z.B Ki67 als Marker für Zellproliferation oder wie in unserem Beispiel der Transkriptionsfaktor Stat5 in Abb. 2) ist der zu messende Bereich mit dem Kern ident, der mittels der nukleären Maske erkannt wird. Im Falle von
zytoplasmatisch/membranös lokalisierten Proteinen muss eine andere Maske verwendet werden, die außerhalb des Zellkerns gewählt wird. Ein Algorithmus, der "Grew in Stained Area" genannt wird, geht von den identifizierten Zellkernen aus und sucht gefärbte Bereiche im entsprechenden Farbkanal, die um jeden Zellkern angeordnet sind. Werden gefärbte Pixel um einen Zellkern gefunden, beginnt die Zytoplasmatische/Membranmaske pixelweise und kontinuierlich zu wachsen, bis keine Farb-Pixel mehr erkannt werden oder eine maximale Größe erreicht ist. Die ist sowohl für IHC als auch für IF Analysen anwendbar (siehe Abb. 3). Ab einer Zahl von mehr als drei unterschiedlichen Markern, die gleichzeitig nachgewiesen werden, muss die IF Methode angewandt werden. Kontrollfärbungen mit nur je einer Färbung werden immer parallel zur richtigen Cut-Off Setzung angesetzt und ausgewertet.

Ausblick
Unter der Voraussetzung einer optimalen und standardisierten Prozessierung und Färbung des Tumormaterials, auf die hier nicht näher eingegangen werden konnte, zeigt die quantitative Bildanalyse von gefärbten Gewebsschnitten viele Vorteile, die eine exakte und weitgehend objektive Diagnose ermöglichen. In Zukunft kann diese Methodik auch für den Hochdurchsatz einschließlich prognostischer Marker-Validierung, die Identifizierung von neuen Targets und Bewertung der Wirksamkeit gezielte Behandlung eingesetzt werden.

Literatur
[1] Hanahan D, Weinberg RA.: Cell.; 144(5): 646-74 (2011)
[2] Savage DG, Antman KH.: N Engl J Med.; 346(9): 683-93 (2002)
[3] Zhang H. et al.: J Clin Invest. ;117(8):2051-8 (2007)
[4] Rudiger T. et al.: Am J Surg Pathol.; 26(7): 873-82 (2002)
[5] Walker RA.: Histopathology. ;49(4):406-10 (2006)
[6] Taylor CR, Levenson RM.: Histopathology. 49(4): 411-24 (2006)
[7] Schlederer M, et al.: PloS one. 9(7):e100822 (2014)

Autoren
Helmut Dolznig1, Lukas Kenner1,2,3,4

1 Institute of Medical Genetics, Medical University of Vienna

2 Ludwig Boltzmann Institute for Cancer Research

3 Clinical Institute of Pathology, Medical University of Vienna

4 Unit of Pathology of Laboratory Animals, University of Veterinary Medicine Vienna

 

 

Kontaktieren

Medizinische Universität Wien
Währinger Gürtel 18 - 20
1090 Wien
Österreich

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.