Raman-Spektroskopie zur Prüfung von Impfstoffen

Überprüfung der Arzneimittelidentität durch die Etablierung neuer Methoden

  • Abb. 1: Luftgetrocknete Impfstoffproben auf einem Objektträger. Abb. 1: Luftgetrocknete Impfstoffproben auf einem Objektträger.
  • Abb. 1: Luftgetrocknete Impfstoffproben auf einem Objektträger.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der Raman-spektroskopischen Analytik. A: Raman-Mikrospektroskopischer Aufbau. Der Raman-Anregungslaser (ωL) wird in ein Lichtmikroskop eingekoppelt und mittels eines Objektives auf die Probe fokussiert. Das rückgestreute Licht wird mit demselben Objektiv gesammelt und auf den Spektrometer Eintrittspalt abgebildet. Mit Hilfe eines Notch-Filters werden nur die inelastisch gestreuten und damit die frequenzverschobenen Lichtanteile analysiert. Das Raman gestreute Licht ist langwelliger (energieärmer (ωL-vib) als das Anregungslicht (Stokes shift). B: Datenpipeline: Im hyperspektralen Datenwürfel repräsentiert jede Pixelposition ein Spektrum. Die Daten werden in eine 2D-Datenmatrix überführt und vorbehandelt. Anschließend kann mithilfe multivariater Statistik und maschinellem Lernens eine Datenbank für die unterschiedlichen Probenklassen erstellt und für die Identifikation von unbekanntem Probenmaterial genutzt werden.
Im Europäischen Arzneibuch werden Prüfmethoden und Charakteristika von Arzneimitteln beschrieben. Mit den dort beschriebenen Prüfungen werden Aspekte, wie Identität, Sicherheit und Wirksamkeit der Arzneimittel erfasst. Während die Chargen klassischer Pharmazeutika nur vom Hersteller geprüft und zur Vermarktung freigegeben werden, müssen biomedizinische Arzneimittel, wie z.B. Impfstoffe, vor der Vermarktung von der dazu autorisierten staatlichen Behörde, in Deutschland das Paul-Ehrlich-Institut, geprüft und freigegeben werden. Nach der Vermarktung werden Arzneimittel zudem von Apothekern und Landesbehörden auf Ihre Echtheit und Integrität regelmäßig überprüft.
 
Schwingungsspektroskopische Methoden sind im Europäischen Arzneibuch bereits als Prüfmethoden etabliert (Europäische Pharmacopoeia (Ph. E.) Kapitel 2.2.24 und 2.2.48). Sie werden in der pharmazeutischen Produktion für die Überwachung von Produktionsprozessen und die Kontrolle von pharmazeutischen Ausgangssubstanzen, Hilfs- und Wirkstoffen routinemäßig eingesetzt. Ein neues Anwendungsfeld sind die Arzneimittelfälschungen, die regelmäßige und rasche Kontrollmethoden erfordern [1]. Bislang ist die Anwendung der Raman-Spektroskopie und der Infrarotspektroskopie auf klassische chemische Arzneimittel beschränkt.
 
Raman-spektroskopische Analytik
Mittlerweile werden die inzwischen weiterentwickelten Techniken aber auch für zellbiologische und biomedizinische wissenschaftliche Fragestellungen herangezogen. Die moderne Raman-spektroskopische Analytik verbindet die Raman-Spektroskopie mit hoch sensitiven Detektionstechnologien, leistungsstarken Lasern, fortschrittlichen optischen Systemen und innovativer Datenanalyse [2,3]. Da die Methodik grundsätzlich für eine Analyse komplexer Gemische, wie sie in Impfstoffformulierungen enthalten sind, geeignet erschien, wurde die Anwendbarkeit der Raman-Spektroskopie für die Identitätsprüfung von Impfstoffen getestet.
Bei der Raman-Spektroskopie werden Moleküle oder Festkörper mit Laserlicht bestrahlt. Das von der Probe zurückgestreute Licht wird spektroskopisch untersucht. Dabei werden zunächst die elastisch gestreuten Photonen, welche dieselbe Frequenz wie die eingestrahlten Laserphotonen aufweisen (Rayleigh-Strahlung), durch einen Notch-Filter eliminiert.

Von analytischem Wert sind nur die inelastisch gestreuten und damit die frequenzverschobenen Lichtanteile. Die Frequenz-Verschiebungen sind spezifisch für die molekularen Schwingungen innerhalb des bestrahlten Probenvolumens und repräsentieren damit indirekt seine molekulare Zusammensetzung. Das Ergebnis der spektroskopischen Messung des inelastisch gestreuten Lichtes ist ein Raman-Spektrum (benannt nach dem Entdecker und Physiker Chandrasekhara Venkata Raman) [4].

 
Diese auf Licht basierende, kontaktfreie Messmethode liefert demnach einen molekularen Kontrast, der die Identifikation molekularer Spezies im bestrahlten Probenvolumen ermöglicht. Man spricht auch von einem sogenannten molekularen Fingerabdruck, der die schnelle und einfache Identifizierung von Molekülen erlaubt. Dabei wird ohne künstliche Markierung gearbeitet. Die Raman-Streuung kann mit Mikroskopen oder speziellen Raman-Sonden detektiert werden.
 
Identitätsprüfung von Impfstoffen
Unter Anwendung dieser Technik wurden getrocknete Proben (Abb. 1) von verschiedenen kommerziell erhältlichen Impfstoffen, die bakterielle Komponenten (Diphtherie-, Tetanus- und Pertussis- (Keuchhusten)-Antigene) enthalten, untersucht. Diese Impfstoffe sind Bestandteil der im Impfkalender vorgesehenen Grundimmunisierung für Säuglinge und den Auffrischimpfungen für Kinder und Erwachsene. Neben sogenannten monovalenten Impfstoffen, die Impfantigene nur eines Krankheitserregers enthalten, wurden auch Kombinationspräparate bis hin zu Sechsfachimpfstoffen in die Untersuchungen einbezogen. Letztere enthalten neben den genannten bakteriellen Komponenten zusätzlich Haemophilus influenzae Bestandteile und virale Antigene der Erreger von Kinderlähmung (Polio) und Hepatitis B.
Als zielführend erwies sich ein Ansatz, bei dem die Impfstoffproben getrocknet wurden und im Raman-Mikroskop an verschiedenen Rasterpunkten gemessen werden (Abb. 2). Die Forscher erstellten aus den luftgetrockneten Impfstoffproben Raman-Maps, um die Impfstoff-spezifischen Raman-Signaturen zu analysieren. Bei einem Raman-Map wird ein definierter Probenbereich Punkt für Punkt im Raster abgefahren. Jeder Pixel an Position y,x repräsentiert ein Spektrum und damit die ortsaufgelöste molekulare Information der Probe (Abb. 2B). Um eine Impfstoff-spezifische Raman-Signatur zu ermitteln, wurden die Daten eines Raman-Maps in eine 2D-Datenmatrix überführt und die Spektren von einzelnen Pixelpositionen gemittelt. Somit konnten die charakteristischen molekularen Informationen eines Impfstoffprodukts in angemessener Qualität abgebildet werden.
 
Ergebnisse
Tatsächlich ließen sich die Impfstoffe über Raman-Signaturen unterscheiden und identifizieren. Die Untersuchungen bestätigen, dass sich mit der Raman-Spektroskopie als Analysemethode auch Hersteller-spezifische Formulierungen klassifizieren lassen. Elf Impfstoffprodukte mit entweder gleichen Antigenkombinationen und oder den gleichen Kombinationen an Adjuvantien wurden untersucht. Die subtilen Unterschiede in der Impfstoffformulierung spiegelten sich im Raman-Spektrum wieder und konnten somit zur Klassifizierung herangezogen werden. Für die Validierung wurden pro Impfstoffprodukt mindestens zehn technisch unabhängige Replikate vermessen. Die Identifizierung der DTaP Impfstoffprodukte war dabei zu 100% erfolgreich. Die Ergebnisse bieten eine gute Ausgangsbasis für die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Testsystems für die Identifikation von Impfstoffen und möglicherweise auch den Einsatz in der Qualitätsprüfung [5].
Darauf aufbauende Untersuchungen sollen zeigen, ob sich detailliertere Informationen aus den Spektren extrahieren lassen. Für die Untersuchung von reinen Substanzen oder einfachen Mixturen können die Raman-Spektren mit Referenzen verglichen und die einzelnen Raman-Banden zugeordnet und identifiziert werden. Die Raman-spektroskopischen Informationen von heterogenen Probenmatrices oder komplexen biologischen Proben werden durch maschinelles Lernen zugänglich gemacht [2]. Um die gemessenen Raman-Spektren in biologisch relevante Informationen zu übersetzen, müssen die Daten über eine geeignete Datenpipeline bearbeitet werden. Neben der Standardisierung der Probenvorbereitung und -messung ist eine geeignete Datenvorbehandlung notwendig [6]. Diese umfasst verschiedene Kalibrierungsmethoden sowie die Korrektur von Artefakten und geräteabhängigem Rauschen. Datenbanken von unterschiedlichen Probenklassen werden mit Hilfe von multivariater Statistik und maschinellem Lernen erstellt. Ziel ist es dabei, die spezifischen Raman-Signaturen einer definierten Probenklasse in einem statistischen Modell zu erfassen, welches dann die Zuordnung und Identifizierung von neuen unbekannten Proben ermöglicht [2,3]. Mithilfe eines innovativen Konzeptes zur Datenanalyse können folglich Erkenntnisse über die Korrelation molekularer Signaturen von unterschiedlichen Probenklassen im Raman-Spektrum und deren eventuellen Veränderungen durch Störungen des Probensystems einfach, schnell und sicher detektiert werden.
 
Fazit
Es konnte gezeigt werden, dass mit der Raman-Spektroskopie ein Untersuchungsverfahren zur Verfügung steht, das ein Impfstoffprodukt-spezifisches Spektrenmuster liefert [5]. Damit steht ein Verfahren zur Verfügung, das nach Etablierung einer Datenbank mit Referenzspektren zur raschen Identifizierung von Impfstoffen bei Arzneimittelfälschungen und möglicherweise in der Chargenprüfung eingesetzt werden kann.
 

Autoren
Anja Silge1,2, Walter Matheis3, Björn Becker3, Thomas Bocklitz1,2,4, Jürgen Popp1,2,4, Isabelle Bekeredjian-Ding3

Zugehörigkeiten
1Institut für Physikalische Chemie und Abbe Center of Photonics, Friedrich-Schiller Universität Jena, Deutschland
2InfectoGnostics Forschungscampus Jena, Zentrum für Angewandte Forschung, Jena, Deutschland
3Abteilung Mikrobiologie, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland
4Leibniz-Institut für Photonische Technologien, Jena, Deutschland

Kontakt
Prof. Dr. Isabelle Bekeredjian-Ding

Abteilung Mikrobiologie
Paul-Ehrlich-Institut
Langen, Deutschland
Isabelle.Bekeredjian-Ding@pei.de
 

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Literatur
[1] Rebiere, Hervé; Martin, Maxime; Ghyselinck, Céline; Bonnet, Pierre-Antoine; Brenier, Charlotte (2018): Raman chemical imaging for spectroscopic screening and direct quantification of falsified drugs. In: Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 148, S. 316–323. DOI: 10.1016/j.jpba.2017.10.005
[2] Bocklitz, Thomas W.; Guo, Shuxia; Ryabchykov, Oleg; Vogler, Nadine; Popp, Jürgen (2016): Raman Based Molecular Imaging and Analytics. A Magic Bullet for Biomedical Applications!? In: Analytical chemistry 88 (1), S. 133–151. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04665
[3] Krafft, Christoph; Schmitt, Michael; Schie, Iwan W.; Cialla-May, Dana; Matthäus, Christian; Bocklitz, Thomas; Popp, Jürgen (2017): Label-Free Molecular Imaging of Biological Cells and Tissues by Linear and Nonlinear Raman Spectroscopic Approaches. In: Angewandte Chemie (International ed. in English) 56 (16), S. 4392–4430. DOI: 10.1002/anie.201607604
[4] Petry, Renate; Schmitt, Michael; Popp, Jürgen (2003): Raman spectroscopy--a prospective tool in the life sciences. In: Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry 4 (1), S. 14–30. DOI: 10.1002/cphc.200390004
[5] Silge, Anja; Bocklitz, Thomas; Becker, Bjoern; Matheis, Walter; Popp, Juergen; Bekeredjian-Ding, Isabelle (2018): Raman spectroscopy-based identification of toxoid vaccine products. In: NPJ vaccines 3, S. 50. DOI: 10.1038/s41541-018-0088-y
[6] Dörfer, Thomas; Bocklitz, Thomas; Tarcea, Nicolae; Schmitt, Michael; Popp, Jürgen (2011): Checking and Improving Calibration of Raman Spectra using Chemometric Approaches. In: Zeitschrift für Physikalische Chemie 225 (6-7), S. 753–764. DOI: 10.1524/zpch.2011.0077.

 

 

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