Ribolution: Automatisiertes Screening und Validierung von RNA-Biomarkern

Das Ribolution-Projekt: Der demographische Wandel stellt die Gesellschaft und die Finanzierung des öffentlichen Gesundheitssystems vor große Herausforderungen. Fehlende diagnostische Werkzeuge verhindern aktuell, dass die Ausprägung, Schwere und das Stadium der Krankheit korrekt und kosteneffizient analysiert werden können. Mit Ribolution wird hier ein neuer Ansatz zum automatisierten Biomarker-Screening präsentiert. Durch Miniaturisierung der qPCR Assays und flexible Hardware Lösungen, konnten Komplexität und Kosten für eine erfolgreiche Validierung drastisch gesenkt werden.

Moderne Verfahren der molekularen Diagnostik zeigen Lösungen auf, die das Potential haben unseren Umgang mit Krankheiten und unser Gesundheitssystem zu revolutionieren. Die Konzentration spezieller RNA-Moleküle in Blut, Urin oder Gewebe, so genannter Biomarker, wird hierbei zur frühzeitigen Diagnose und Prognose von Krankheiten eingesetzt. Die Diagnose über Biomarker eröffnet ein deutlich differenzierteres Behandlungsspektrum, das spezifisch auf den Patienten zugeschnitten ist. Hierdurch ist mit deutlich sinkenden Kosten zu rechnen, da der Bedarf an kostenintensiven intensivmedizinischen Behandlungen und Medikamenten reduziert werden kann.

Die Nachfrage nach krankheitsspezifischen Biomarkern ist entsprechend hoch und wächst stetig [1]. Die Erforschung und Validierung von aussagekräftigen Indikatoren ist jedoch mit hohen Kosten und experimentellem Aufwand verbunden [2]. Insbesondere die systematische Validierung möglicher Biomarker anhand großer Patientenkohorten stellt die meisten Forschungsvorhaben vor unüberwindbare logistische wie finanzielle Probleme. Aktuell kann daher die Nachfrage des Marktes nach Biomarkern für die meisten Krankheiten nicht gedeckt werden.

Mit dem Ribolution Projekt [3] stellt sich ein interdisziplinäres Konsortium aus fünf Fraunhofer Instituten (IPA, IZI, IGB, ITEM, FIT) den Herausforderungen ein leistungsfähiges und intelligentes Biomarker Screening zu etablieren. In enger Kooperation mit mehreren deutschen Universitäten (Leipzig, Dresden) sowie der Industrie (GSK) beschreitet Fraunhofer hierbei neue Wege des integrierten Biomarker-Screenings.

Das Projekt wird aufgrund seiner wissenschaftlichen wie ökonomischen Relevanz für den Wirtschaftsstandort Deutschland von der Fraunhofer Zukunftsstiftung gefördert.

Next-Generation Biomarker-Screening
Das Konsortium hat eine mehrstufige Entwicklungspipeline zur Biomarker Identifizierung und Validierung etabliert. Qualität, Performance und Kosten sind die zentralen Säulen, die der Entwicklung zu Grunde liegen. Die Entwicklungspipeline adressiert erstmals und umfassend alle Schritte von der Gewinnung der Blut bzw. Gewebespende bis zu Validierung und Vermarktung der Biomarker.

Durch die Adressierung einer bisher im Screening Umfeld nur selten betrachteten Klasse von RNA, der so genannten nicht-kodierenden RNA (ncRNA), bietet das Projekt ein hohes Verwertungspotential und ein attraktives Anknüpfungsfeld für KMUs im diagnostischen Markt. Aufgrund der regulatorischen Funktion von ncRNA im Organismus stellen diese ein vielversprechendes Target für eine Vielzahl von Erkrankungen dar. Die systematische Entwicklung von ncRNA basierten Biomarkern bringt eine hohe logistische wie experimentelle Komplexität mit sich. Durch die entwickelten Methoden und Automatisierungslösungen ist erstmals ein „kostengünstiges“ Screening in angemessener Zeit möglich. Im laufenden Projekt wird dies exemplarisch an den gesellschaftlich und ökonomisch relevanten Erkrankungen Prostatakrebs, COPD sowie chronischer Lungenentzündung demonstriert.

In einer ersten Screening- Phase wird eine kleine gut charakterisierte Patientenkohorte mittels Next-Generation- Sequencing analysiert. Gesundes und krankes Gewebe wird hinsichtlich Abweichungen in der RNA-Sequenz verglichen um mittels leistungsfähiger Bioinformatikmethoden mögliche Biomarker- Kandidaten zu erarbeiten.

Die Qualität der verwendeten RNA-Proben und die korrekte Annotation des Krankheitsstadiums wirken sich äußerst kritisch auf die Güte der Sequenzierung und Charakterisierung der Biomarker-Kandidaten aus. Durch optimierte Verfahren zur Extraktion der RNA aus Gewebe, Blut bzw. Urin wird diesen Qualitätsanforderungen hier eine hohe Gewichtung gegeben. Alle Schritte der Spendengewinnung und Aufbereitung werden in enger Abstimmung zwischen Klinik, molekularbiologischer Analytik und Prozessautomatisierung optimiert und in neue Qualitätsstandards etabliert.

Der Screening-Phase schließt sich eine Validierung der vorab charakterisierten Biomarker-Kandidaten an. Mittels quantitativer realtime PCR werden die identifizierten Kandidaten anhand großer Kohorten von bis zu 500 Patienten pro Erkrankung getestet. Für die adressierten Erkrankungen und Kohorten fallen somit ca. 500.000 PCR-Testpunkte für die Validierung an.

Basierend auf der I-Dot Technologie [6] setzt das Projekt qPCR-basierte Diagnostik auf neue Skalen um. Die Miniaturisierung der Ansätze auf Submikroliter Maßstäbe und das präzise Dosieren von Einzelmedien im Bereich von wenigen Nanolitern eröffnet neue und kostengünstige Wege der Automatisierung. Insbesondere die damit einhergehende Reduktion der Verbrauchskosten pro Datenpunkt (Abb. 1) sowie der geringe Bedarf an Spender-RNA stellen Vorteile gegenüber konventionellen Screening- Strategien dar. Die Reduktion der Volumina der PCRReaktionsansätze ermöglicht darüber hinaus die Parallelisierung auf kleinstem Raum (1536 Testpunkte pro Mikrotiterplatte).

Erstmals wurde bei der Integration und Vernetzung der Geräte konsequent auf die Verwendung SiLA kompatibler Geräte und Gerätetreiber [7] gesetzt. SiLA definiert eine standardisierte Kommunikationsschnittstelle, die eine schnelle und einfache Vernetzung von Anlagenkomponenten ermöglicht. Die vernetzte Hardware wird durch die Steuer- und Scheduling- Software LACS zu einem Entwicklungstool komplettiert. Durch die Verknüpfung von SiLA und LACS kann die Laborinfrastruktur für ein Screening Projekt smart und schlank gehalten werden, ohne dabei auf Prozesssicherheit und Performance zu verzichten. Darüber hinaus können Servicezeiten für Reparaturen und Geräteintegration reduziert und effizienter gestaltet werden, was Innovationsräume für zukünftige Automatisierungslösungen eröffnet.

Ribolution Screening-Center
Durch die aufgezeigten Arbeiten und Entwicklungen wird es dem biologischen Forscher sowie der pharmazeutischen Industrie möglich mit kalkulierbarem Aufwand und Kosten neue Biomarker zu entwickeln. Die für das Screening erforderliche RNA-Menge pro Marker-Kandidat kann durch die Prozessminiaturisierung und die Möglichkeit der Dosierung von einzelnen Nanolitern um bis zu 98% reduziert werden (Abb. 2). Es ist zu erwarten, dass durch den geringen Bedarf an RNA sowie die aufgezeigte Screening-Pipeline der Zugang zu den Kohorten und RNA-Banken deutlich erleichtert wird. Der Zeitvorteil gegenüber konventionellen Lösungen kann direkt in einen wissenschaftlichen sowie wirtschaftlichen Wettbewerbsvorteil und Entwicklungsvorsprung umgesetzt werden.

Ausblick
Um die Technologien unmittelbar für neue Projektpartner zugänglich zu machen und neue Krankheitskohorten dem Screening zuzuführen, soll in einer zweiten Förderphase das Ribolution Screening- Center gegründet werden. Dieses bündelt die entwickelten Technologien und bietet zahlreiche Schnittstellen zu KMUs und möglichen Lizenz- und Verwertungspartnern. Die Autoren sind davon überzeugt, dass das Projekt die führende Position des deutschen Forschungs- und Wirtschaftsstandort im Bereich molekulare und personalisierte Diagnostik festigen und weiter ausbauen wird.

Literatur
[1] Frost & Sullivan, Advances in Biomarkers, D19A-01 Seite 01, 2009
[2] Frost & Sullivan, Advances in Biomarkers, D19A-01 Seite 32, 2009
[3] http://www.ribolution.org, 11/2013
[4] Mattick J. S. : Band 15 Spec No 1, April 2006
[5] BIOforum Europe, GIT Verlag, Vol13, July 2009
[6] i-doT-System – Bioproduktion am Fraunhofer IPA; http://www.bioproduktion.com/idoT.html, 11/2013
[7] SiLA Rapid Integration | Standardization in Lab Automation. http://www.sila-standard.org; 11/2013

Autoren
Dipl.-Phys. Mario Bott,
M. Sc. Christopher Laske,
Dipl.-Ing. Andreas Traube (Abteilungsleiter), Fraunhofer IPA

Kontakt
Dipl.-Phys. Mario Bott
Tel.: 0711/970-1029
Fax: 0711/970-1005

Kontaktieren

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Nobelstr. 12
70569 Stuttgart
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Telefax: +49 711 970-1399

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