Schimmelpilzgiften im Cannabis auf der Spur

Analyse von Mykotoxinen mit HPLC und Fluoreszenzdetektion

  • Abb. 1: Chromatographie von 2 ppm Aflatoxin G1 (links) und 10 ppm Ochratoxin A (rechts).Abb. 1: Chromatographie von 2 ppm Aflatoxin G1 (links) und 10 ppm Ochratoxin A (rechts).
  • Abb. 1: Chromatographie von 2 ppm Aflatoxin G1 (links) und 10 ppm Ochratoxin A (rechts).
  • Abb. 2: Chromatogramm von Kanal 1 (oben) und 3 (unten) einer 10 ppb gespikten Probe.
  • Tab. 1: Analytische Bedingungen der HPLC-Messungen.
  • Tab. 2: Ergebnistabelle der Wiederfindung.
Mykotoxintests von Cannabis sind wichtig, um Verbraucher vor gesundheitlichen Schäden zu schützen. In diesem Artikel wird eine HPLC-Methode mit Fluoreszenzdetektion vorgestellt, mit der sich Mykotoxine zuverlässig und sensitiv nachweisen lassen.
 
Wachsende Bedeutung von Cannabis
Die Hanfpflanze (Cannabis sativa L.) ist eine alte Kulturpflanze aus Asien, die heute auch in Europa weit verbreitet ist. Einige Zeit durfte sie aber in Deutschland nicht angebaut werden, wegen ihres psychoaktiven Wirkstoffs Δ9-THC (Δ9-Tetrahydrocannabinol).
Das Interesse von Landwirtschaft und Industrie an der Hanfpflanze ging aber nicht verloren. Und so ist es seit 1996 wieder erlaubt, sie als Δ9-THC-arme Nutzpflanze in Deutschland zu kultivieren. Die Nahrungsmittelindustrie bietet eine Vielzahl von hanfhaltigen Produkten an, wie Hanföl, Hanfmehl, Hanfproteinpulver oder Hanfgetränke, die aus den Hanfsamen hergestellt werden. Die Hanfsamen und das daraus gewonnene Hanföl sind ernährungsphysiologisch besonders wertvoll, da sie reich an mehrfach ungesättigten Fettsäuren und essenziellen Aminosäuren sind [1].
Seit März 2017 gibt es für schwerkranke Menschen die Möglichkeit, Cannabis auf Rezept zu erhalten, wenn es den Verlauf der Krankheit verbessern oder deren Symptome abmildern kann. Gute Ergebnisse werden in der Schmerztherapie, bei schwerer Übelkeit und Erbrechen, Appetitverlust und bei chronischen Erkrankungen erwartet.
Für die medizinische Anwendung werden psychoaktive Cannabissorten benötigt, die Δ9-THC in höherem Maße enthalten. Ein weiterer wichtiger medizinischer Wirkstoff ist das nicht psychoaktive CBD (Cannabidiol). Beide Cannabinoide sind in den einzelnen Hanfsorten in unterschiedlichem Grad vorhanden und erzeugen somit beim Patienten auch dementsprechende Wirkungen. Um die Versorgung mit Cannabispräparaten (Cannabisblüten oder Cannabisextrakt) in Arzneimittelqualität zu gewährleisten, wurde eine staatliche Cannabisagentur geschaffen, die den Anbau und Vertrieb von medizinischem Cannabis in Deutschland steuert und kontrolliert [2].
 
Mykotoxine in Cannabis
Cannabis kann von Schimmelpilzen befallen sein.

Sie produzieren giftige Stoffwechselprodukte, die sogenannten Mykotoxine.

Aflatoxine und Ochratoxine sind Mykotoxine, die von Schimmelpilzarten der Gattungen Aspergillus gebildet werden. Studien haben gezeigt, dass viele Mykotoxine einschließlich Alfatoxin B1, B2, G1, G2 und Ochratoxin A bei Menschen zu ernsthaften Erkrankungen führen können. Sie können das Immunsystem schwächen, Krebserkrankungen erzeugen, das zentrale Nervensystem angreifen und die Leber schädigen. Der Schimmel selbst verursacht unter Umständen auch Erkrankungen wie eine Lungenentzündung und Aspergillose.
Angesichts des großen Risikos für die Gesundheit der Verbraucher ist die Entwicklung genauer Testmethoden für Mykotoxine in Cannabis von äußerster Wichtigkeit [3,4]
 
Mykotoxintests von Cannabis
Aufgrund der komplexen Matrix sind Mykotoxin-Tests in Cannabis-Produkten sehr anspruchsvoll. Mit Hilfe der HPLC und Fluoreszenzdetektion können diese Mykotoxine auch in Matrix hochselektiv und empfindlich bestimmt werden, da sie fluoreszieren.
 
Probenvorbereitung
Die Proben werden mit einer Mühle homogenisiert. Anschließend werden die Proben mit Methanol-Wasser versetzt, geschüttelt und zentrifugiert. Der Überstand wird mit 1x PBS/2 % Tween-Waschpuffer versetzt und gut gemischt. Der verdünnte Extrakt wird anschließend auf eine AflaOchra-Säule gegeben; er läuft mit einer Geschwindigkeit von 1-2 Tropfen pro Sekunde durch, bis Luft durch die Säule kommt. Sie wird mit PBS/2% Tween-Puffer und anschließend HPLC-grade Wasser gewaschen. Die Toxine werden anschließend mit Methanol von der Säule eluiert und in die HPLC injiziert.
Alle Standards wurden in Matrix gespiked und extrahiert.
 
Fluoreszenzdetektion
Die Messungen wurden mit einer kompakten HPLC (Prominence-i, Shimadzu), ausgestattet mit einem Fluoreszenzdetektor (RF-20Axs), durchgeführt. In Tabelle 1 werden die analytischen Bedingungen der HPLC-Messungen gezeigt.
 
Ergebnisse
Die Anregung bei 365 nm und Emission bei 450 nm (Kanal 1) erwiesen sich als optimal für die Aflatoxine (Abb. 1 links). Für das Ochratoxin A zeigte sich die Anregung bei 330 nm und die Emission bei 460 nm (Kanal 3) als geeignet (Abb. 1 rechts).
Für die Wiederfindung wurden Proben mit 10 ppm der Mykotoxine gespiked. Abbildung 2 bildet die entsprechenden Chromatogramme einer solchen Probe ab, Tabelle 2 die Ergebnisse der Wiederfindung.
 
Fazit
Mit der gezeigten HPLC-Fluoreszenzmethode lassen sich die Mykotoxine in Cannabis zuverlässig nachweisen. Die Methode ist sensitiv und robust. Der Detektor ist ein effektives Werkzeug auch für Analysen im Ultraspurenbereich.

 

​Autorin
Vanessa Breutner

 

Kontakt
Vanessa Breutner

Produktspezialistin HPLC/BioTech
Shimadzu Deutschland GmbH
Duisburg, Deutschland
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

 

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Literatur

[1]  https://www.verbraucherzentrale.de/wissen/lebensmittel/kennzeichnung-und-inhaltsstoffe/hanfhaltige-lebensmittel-12881 [zuletzt aufgerufen am: 12.07.19]

[2] https://www.bundesgesundheitsministerium.de/ministerium/meldungen/2017/maerz/cannabis-als-medizin-inkrafttreten.html [zuletzt aufgerufen am: 12.07.19]

[3] Hazenkamp A. An evaluation of the quality of medicinal grade cannabis in the Netherlands. Cannabinoids. 2006; 1(1):1-9.

[4] Sedmikova M., Reisnerova H., Dufkova Z., Barta I., Jilek F. Potential hazard of simultaneous occurrence of aflatoxin B1 and ochratoxin A. Veterinary Medicine - Czech. 2001; 46(6): 169-174.
 

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