Tropfenbasierte Mikrofluidik: Sensitiver Nachweis seltener Mutationen

  • Abb. 1: Prinzip der Nachweismethode. Wir wollen eine seltene Mutantensequenz (grün) in einem Ensemble normaler Sequenzen finden (a). Aufgrund der Verdünnung ist die Messung des Signals von der mutierten Sequenz im Hintergrund der normalen Sequenz erschwert. Wir verkapseln Einzelgene in Tropfen (à ~10 Mikron) mit einem Fluoreszenzmarker, der auf die gewünschte Sequenz abgestimmt ist (grün für ein mutiertes Gen, rot für ein normales) (b) und amplifizieren jede Sequenz im Tropfen (c). Der ganze Tropfen wird fluoreszent: ein grüner Tropfen enthält ein mutiertes Gen, ein roter Tropfen ein normales Gen und ein weißer Tropfen keins von beiden. Das einfache Zählverfahren roter und grüner Tropfen liefert ein Maß für das Anfangsverhältnis von mutierten zu normalen Genen.Abb. 1: Prinzip der Nachweismethode. Wir wollen eine seltene Mutantensequenz (grün) in einem Ensemble normaler Sequenzen finden (a). Aufgrund der Verdünnung ist die Messung des Signals von der mutierten Sequenz im Hintergrund der normalen Sequenz erschwert. Wir verkapseln Einzelgene in Tropfen (à ~10 Mikron) mit einem Fluoreszenzmarker, der auf die gewünschte Sequenz abgestimmt ist (grün für ein mutiertes Gen, rot für ein normales) (b) und amplifizieren jede Sequenz im Tropfen (c). Der ganze Tropfen wird fluoreszent: ein grüner Tropfen enthält ein mutiertes Gen, ein roter Tropfen ein normales Gen und ein weißer Tropfen keins von beiden. Das einfache Zählverfahren roter und grüner Tropfen liefert ein Maß für das Anfangsverhältnis von mutierten zu normalen Genen.
  • Abb. 1: Prinzip der Nachweismethode. Wir wollen eine seltene Mutantensequenz (grün) in einem Ensemble normaler Sequenzen finden (a). Aufgrund der Verdünnung ist die Messung des Signals von der mutierten Sequenz im Hintergrund der normalen Sequenz erschwert. Wir verkapseln Einzelgene in Tropfen (à ~10 Mikron) mit einem Fluoreszenzmarker, der auf die gewünschte Sequenz abgestimmt ist (grün für ein mutiertes Gen, rot für ein normales) (b) und amplifizieren jede Sequenz im Tropfen (c). Der ganze Tropfen wird fluoreszent: ein grüner Tropfen enthält ein mutiertes Gen, ein roter Tropfen ein normales Gen und ein weißer Tropfen keins von beiden. Das einfache Zählverfahren roter und grüner Tropfen liefert ein Maß für das Anfangsverhältnis von mutierten zu normalen Genen.
  • Abb. 2: Mikrofluidik wird für die Verkapselung von Genen verwendet, um Tropfen von exakt derselben Größe zu erhalten (a,b). Die nach der Amplifizierung der Gene erhaltenen fluoreszenten Tropfen werden gezählt, um das Anfangsverhältnis von mutierten zu normalen Genen zu bestimmen. (b) Beispiele von Tropfen einer Größe von ca. 50 Mikron Durchmesser, die mittels Mikrofluidik produziert werden und entweder Fluoreszein (grün) oder Resorufin (rot) enthalten oder leer sind (schwarz).
  • Dr. Valérie Taly, Université Paris Descartes, INSERM UMR-S775, Paris Cedex und ISIS-CNRS-Université de Strasbourg, Strasbourg, Frankreich, Dr. Jean- Christophe Baret, Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbst-Organisation, Göttingen, Deutschland

In der Onkologie ist der Behandlungserfolg bei einer bestimmten Krebsart an die Fähigkeit geknüpft, Tumorzellen so früh wie möglich zu entdecken: Die Früherkennung spielt beim Kampf gegen den Krebs eine wesentliche Rolle. Daher ist es notwendig, Krebs-Biomarker mit Hilfe hochempfindlicher Methoden im Probenmaterial von Patienten aufzuspüren. Eine Zukunftsvision für die Krebsdiagnostik beruht auf der Analyse von Körperflüssigkeiten zum Nachweis dieser Biomarker.

Eine hohe Empfindlichkeit ist dabei eine wichtige Voraussetzung, um genetische Abweichungen in geringsten Mengen in solchen Proben erkennen zu können.Für die meisten Krebsarten wurden komplexe Netzwerke genetischer Modifikationen beschrieben: Deletionen, Amplifikationen, Punktmutationen und Neuordnung von Chromosomen spielen alle eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung und Progression von Krebs [1, 2]. Diese somatischen Mutationen sind in Tumorzellen, aber nicht in normalen Zellen vorhanden und können als hochspezifische Biomarker dienen [3].

Tumorspezifische genetische Veränderungen sind hervorragende Instrumente zur Früherkennung von Krebs und können einen starken Einfluss auf die klinische Entscheidungsfindung und das Ergebnis haben [4, 5]. Der Einsatz solcher Biomarker in der klinischen Onkologie macht es erforderlich, sie in einer großen Menge nicht mutierter DNA von normalen Zellen zu entdecken. Unter den vielen möglichen Biomarkern stellt KRAS ein gutes Modell dar.

Tatsächlich wurde dieses Onkogen in mutierter Form in Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (Häufigkeit 70–90 %), des Darms (50 %) und der Lunge (25–50 %) [6] gefunden, und das Vorhandensein von KRAS Mutationen wird mit einer ausbleibenden Reaktion bei Darmkrebs-Therapien, die anti-EGFRAntikörper verwenden, assoziiert [7]. Die in Kliniken eingesetzten klassischen Methoden, wie zum Beispiel Doppelsonden- TaqMan-Assays und Pyrosequenzierung, sind quantitative Analysen und können daher weniger als ~1 % mutierte Gene vor dem Hintergrund nicht-mutierter DNA normaler Zellen entdecken [8].

Tatsächlich beinhalten die meisten genetischen Tests, die DNA-Sequenz-Variationen nachweisen sollen, einen PCR-Schritt (Polymerase-Kettenreaktion), und diese Methode hat eine eingeschränkte Empfindlichkeit bei der Amplifizierung komplexer DNA-Mischungen (wie z.

B. aus Tumoren, Plasma oder Exkrementen extrahierte DNA).

Eine präzisere und empfindlichere Quantifizierung mutierter DNA wird durch die Verwendung von Digitaltechniken ermöglicht, mit deren Hilfe anstelle eines Pools unterschiedlicher DNAs viele einzelne DNA-Moleküle parallel analysiert werden können. Eine der wichtigsten Methoden ist die digitale PCR, die auf der Kompartimentierung und Amplifizierung einzelner DNA-Moleküle beruht [9]. Die Digital-PCR ermöglicht das diskrete Zählen von mutierten und Wildtyp-Allelen im Probenmaterial.

Ihre Empfindlichkeit wird nur durch die Anzahl der analysierbaren Moleküle und durch die Falsch-positiv-Rate des Mutationsnachweistests begrenzt. Digitale Assays sind besonders gut für die Analyse klinischer Proben wie Stuhloder Plasmaproben geeignet, in denen vom Tumor stammende DNA-Fragmente nur in einem Bruchteil der Gesamt-DNA vorliegen [3], und die digitale PCR wurde zum Nachweis von KRAS-Mutationen in verschiedenen klinischen Proben eingesetzt [9-12]. Die ursprünglichen Mikrotiterplatten- basierten digitalen PCR-Techniken waren jedoch nicht nur langsam, sondern auch teuer.

Um hier Abhilfe zu schaffen, wurden verschiedene miniaturisierte Methoden entwickelt, bei denen Millionen von Einzelmolekül-PCR-Reaktionen in einem einzigen Assay stattfinden können. Die von uns erarbeitete Methode [13] beruht auf dieser Idee. Zur Durchführung des Tests müssen wir einzelne Gene manipulieren und zählen, wobei einige Mutanten sind und der Rest Wildtyp-Gene. Dafür verwenden wir Fluoreszenz-Marker, die an bestimmte Sequenzen andocken: ein roter Marker für ein Wildtyp-Gen, ein grüner für ein mutiertes Gen. Würden wir die Fluoreszenz des Probenmaterials in Rot und Grün messen, müssten wir das Genverhältnis bestimmen können.

Aber wie weiter oben erörtert, würde eine solch allgemeine Strategie keine ausreichende Empfindlichkeit aufweisen, wenn der Mutant in der Probe zu stark verdünnt vorliegt. Wir müssen die roten und grünen Gene auf Einzelmolekülebene zählen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Die Einzelgenanalyse erfordert jedoch komplexe optische Systeme, die recht langsam sind und keine große Anzahl von Analysen liefern. Um diese Probleme zu umgehen, isolieren wir jedes Gen in einzelnen Reaktoren und amplifizieren sie, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken.

Wir messen nicht direkt die Fluoreszenz eines einzelnen Gens, sondern von Millionen von Genen: der ganze Mikroreaktor wird fluoreszent und leicht zu messen. Dazu verwenden wir tropfenbasierte Mikrofluidik-Systeme, die die Bildung hoch monodisperser Tropfen von wenigen Picoliter (<1,5 % Polydispersität) und die genaue Manipulation und optische Analyse der Tropfen in Kilohertz-Frequenzen erlauben. Die Analyse von Millionen von Genen (oder Tropfen) kann dann in weniger als 1 Stunde durchgeführt werden.

Das Zählen von grünen und roten Tropfen bezieht sich einfach auf die anfängliche Verdünnung von Genen in einer quantitativen und sensitiven Art und Weise. Es ermöglichte die präzise Bestimmung des spezifischen Ungleichgewichts eines mutierten Allels (Mutant Allelic Specific Imbalance (MASI)) in verschiedenen Krebszelllinien und die genaue Quantifizierung eines einzelnen mutierten KRASGens vor dem Hintergrund von 200.000 nicht mutierten KRAS-Genen.

Außerdem war es möglich, die sechs gemeinsamen Mutationen im KRAS-Codon 12 parallel in einem einzigen Experiment zu screenen. Eine solche Parallelisierung ist äußerst leistungsstark, da sie nicht nur das Vorhandensein eines Tumors anzeigt, sondern auch klar die hier zu Grunde liegende Mutation nachweist. Diese Information kann dann dazu genutzt werden, um den Onkologen auf die bestmögliche therapeutische Strategie zu bringen.

Dank der Empfindlichkeit und der Quantifizierbarkeit der Methoden wird es vielleicht in der nahen Zukunft möglich sein, Krebs durch einen einfachen Blutoder Urintest zu entdecken. Wir haben unsere Methode erfolgreich auf das KRASOnkogen angewendet. Die dieses Gen tragende DNA stammte von Zelllinien aus dem Labor. Diese neue analytische Methode muss nun in einem therapeutischen Zusammenhang getestet werden.

Eine klinische Studie ist bereits angesetzt. Wenn sie erfolgreich ist, werden Ärzte ein effizientes Diagnoseinstrument an der Hand haben, nicht nur zum Aufspüren eines Tumors, sondern auch, um Therapien vorzuschlagen. Die Aggressivität des Krebses, seine Reaktion auf bestehende Therapien und das Rezidivrisiko nach örtlicher Behandlung: all diese Information ist teilweise in der DNA des Tumors enthalten.

Durch ihre Entschlüsselung mit Hilfe der Mikrotropfen-Technologie könnten Onkologen sich ein starkes Diagnoseinstrument zu Nutze machen, um den Krankheitsverlauf vorhersagen und eine Behandlungsstrategie festlegen zu können.

Literatur

[1] Vogelstein B. et al.: Nat Med, vol. 10, pp. 789–799 (2004)

[2] Stratton M. R et al.: Nature, vol. 458, pp. 719–724 (2009)

[3] Diehl F. et al.: Nat Med, vol. 14, pp. 985-990, (2008)

[4] Negm R. S. et al.: Trends Mol Med, vol. 8, pp. 288–293 (2002)

[5] Sawyers: C. L.: Nature, vol. 452, pp. 548–552 (2008)

[6] Johnson L. et al.: Nature, vol. 410, pp. 1111–1116 (2001)

[7] Lievre A. et al.: Cancer Res, vol. 66, pp. 3992–3995 (2006)

[8] Tsiatis A. C. et al.: J Mol Diagn, vol. 12, pp. 425–432 (2010)

[9] Vogelstein B. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 96, pp. 9236–9241 (1999)

[10] Dong, S. M. et al.: J Natl Cancer Inst, vol. 93, pp. 858–865 (2001)

Die Autoren stellen gern weitere Literaturangaben zur Verfügung. Zusätzliche Informationen sind in Quellenangabe 13 zu finden: Pekin et al.: Lab. Chip (2011)

Kontakt:

Dr. Jean-Christophe Baret

Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbst-Organisation

Göttingen, Deutschland

Jean-christophe.baret@ds.mpg.de

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