Tumortherapeutika: Neue Perspektiven durch Ribonucleasen

  • Abb. 1: Der Fluss der genetischen Information und Möglichkeiten seiner UnterbrechungAbb. 1: Der Fluss der genetischen Information und Möglichkeiten seiner Unterbrechung
  • Abb. 1: Der Fluss der genetischen Information und Möglichkeiten seiner Unterbrechung
  • Abb. 2: Postulierte zytotoxische Wirkungsweise von Ribonucleasen
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Die Zahl der jährlich neu diagnostizierten Tumorerkrankungsfälle beträgt etwa 10 Millionen. Während weltweit 13 % der Todesfälle durch Tumorerkrankungen verursacht werden, beträgt der Anteil in den Industrienationen nahezu 25 % [1]. Damit nehmen Krebserkrankungen hinter Erkrankungen des Herzkreislaufsystems den zweiten Platz als Ursache aller in Deutschland verursachten Todesfälle ein [2].

Neben operativen Eingriffen existieren als derzeitige Behandlungsmöglichkeiten Radio- und Chemotherapie, die jedoch aufgrund ihrer geringen Selektivität häufig eine hohe systemische Toxizität aufweisen, was zu Nebenwirkungen wie Haarausfall, Durchfall, Schädigung des Immunsystems sowie der Leber, der Nieren und des Knochenmarks führt. Die Suche nach alternativen Therapiemöglichkeiten ist daher eine der größten Herausforderungen der gegenwärtigen Medizin.

Der Fluss der genetischen Information - von der DNA über die RNA zu den die biologische Funktion ausübenden Proteinen - kann grundsätzlich an eben diesen drei Komponenten (DNA, RNA, Proteine) unterbrochen werden (Abb. 1). Je nach Target kann ein solcher Eingriff zu einem Arrest im Zellzyklus oder auch zu einem Absterben der betroffenen Zelle führen. Da Tumorzellen zumeist verstärkte Stoffwechselaktivitäten und höhere Proliferationsraten als normale Zellen aufweisen, sollten die Auswirkungen einer solchen Unterbrechung (z. B. durch Chemotherapeutika) auf Tumorgewebe gravierender sein.

Das Potenzial von RNasen

Ein häufig auftretendes Problem neben der mangelnden Selektivität von traditionellen Chemotherapeutika stellt eine sich ausbildende Resistenz der Zellen dar, sodass eine wiederholte Applikation zumeist nicht zum gewünschten Erfolg führt. Eine Alternative bieten Proteine oder Proteinkon­strukte, gegen die die betroffenen Zellen und Gewebe keine Resistenzen ausbilden. Aufgrund ihrer RNA-abbauenden katalytischen Aktivität wurden Ribonucleasen (RNasen) - Enzyme, die neben der Verdauung von in der Nahrung enthaltener RNA zahlreiche regulatorische Aufgaben innehaben - bereits in den 50er Jahren des vergangenen Jahrhunderts als zytotoxisch und damit als potenzielle Tumortherapeutika angesehen.

Unter Verwendung von RNase A (aus Rinderpankreas) konnte gezeigt werden, dass diese Annahme prinzipiell gerechtfertigt ist [3].

Der Einsatz mikrobieller RNasen scheiterte bisher daran, dass diese RNasen entweder nicht zytotoxisch sind (insbesondere negativ geladene Proteine) oder aufgrund ihres bakteriellen Ursprungs eine starke Immunabwehrreaktion hervorrufen. Vertreter der RNase A-Superfamilie hingegen, der zahlreiche Säuger-RNasen angehören, sind nicht immunogen und binden aufgrund ihrer positiven Nettoladung in vitro selektiv an die Oberfläche von transformierten, d.h. zu Tumorzellen entarteten Zellen, da diese im Vergleich zu denen nicht entarteter Zellen einen höheren Anteil negativ geladener Komponenten (Serin-Phospholipide, Sialinsäure-Kohlenhydrate etc.) aufweisen. Dennoch sind nicht alle Vertreter der RNase A-Superfamilie nach intravenöser bzw. extrazellulärer Applikation zytotoxisch. Insbesondere zeigen die unter immunologischen Aspekten für die Entwicklung von Therapeutika besonders interessanten RNasen aus Säugern kaum Zytotoxizität. Die einzige in dimerer Form vorkommende RNase, die bovine seminal RNase, BS-RNase, ist zwar zytotoxisch, jedoch aufgrund der gleichfalls vorhandenen embryotoxischen und aspermatogenen Wirkung für einen therapeutischen Einsatz nicht geeignet. Tatsächlich weisen aber einige Homologe der RNase A (d. h. Vertreter der RNase A-Superfamilie) deutliche Zytotoxizität auf. Mit Onconase (Tamir Biotechnology), einer RNase aus den Oozyten des Nördlichen Leopardfroschs Rana pipiens, hat ein Vertreter der Superfamilie Phase IIIb die klinischen Tests für maligne Mesotheliome erreicht. Aktuell angestrebte Applikationsgebiete für Onconase liegen jedoch eher auf dem Gebiet durch RNA-Viren hervorgerufener Krankheiten wie Dengue- oder Gelbfieber oder auch Infektionen durch das humane Papillomavirus. Ziel künftiger Forschungen auf dem Gebiet der Tumortherapie ist es jedoch, auf Säuger-RNasen basierende Therapeutika zu generieren. In diesem Zusammenhang sei das Unternehmen Quintessence Biosciences (www.quintbio.com) genannt. Hier befinden sich RI-evasive Varianten von Säuger-RNasen in Phase I der klinischen Testungen und weitere, auf RNasen basierende Therapeutika sind in Entwicklung.

Kriterien für Zytotoxizität

Die Ursachen für die Unterschiede in der Zytotoxizität der verschiedenen RNasen konnten bisher nicht generell aufgeklärt werden. Dennoch ließen sich verschiedene Kriterien für eine Zytotoxizität der RNasen aufzeigen (Abb. 2). Da viele Vertreter der RNase A-Superfamilie eine ausgesprochen hohe katalytische Aktivität und ausgeprägte Stabilität aufweisen, scheinen diese beiden Parameter (auch wenn sie durch Modifizierungen beeinträchtigt werden sollten) keine kritischen Größen darzustellen [4]. Neben der Endozytoseeffizienz und einer geeigneten intrazellulären Verteilung scheint vor allem der intrazelluläre Ribonuclease-Inhibitor (RI), ein hufeisenförmiges Protein, das viele Vertreter der RNase A-Superfamilie hochaffin bindet (die Ki-Werte liegen im femtomolaren Bereich), eine zentrale Rolle zu spielen. Während RNase A (K= 44 fM) nicht zytotoxisch ist (IC50 > 400 µM), zeigt Onconase (Ki = 1 µM) eine ausgeprägte Zytotoxizität (IC50 ≈ 1 µM) gegenüber zahlreichen Tumorzelllinien. Eine Analyse der Struktur des RNase A•RI-Komplexes zeigte eine Vielzahl von Interaktionen an, die für die feste Bindung zwischen dem Inhibitor und dem RNase-Molekül verantwortlich sind. Durch genetic engineering konnten RNase-Mutanten erzeugt werden, die in in vitro-Studien RI-evasiv waren, d. h. für die eine dramatische Verminderung der RI-Bindung erreicht werden konnte. Tatsächlich wiesen diese Varianten auch in vivo eine Zytotoxi­zität auf, die denjenigen RNasen, die per se RI-evasiv sind, ähnelte [5], was die Wechselwirkung zwischen RNase und RI als Schlüsselstellung für die Zytotoxizitätseffizienz erscheinen lässt. Ergebnisse verschiedener anderer Arbeitsgruppen widersprechen dieser Deutung jedoch eindeutig (für Reviews siehe [6,7]).

Neuer Ansatz

In jüngerer Zeit wurden zahlreiche Versuche unternommen, RI-evasive Säuger-RNasen zu generieren. Ein Erfolg versprechender Ansatz war die gentechnische Erzeugung von Dimeren von RNase A bzw. RNase 1 (dem RNase A-Homologen aus dem menschlichen Pankreas), die sich wie die einzige natürliche dimere RNase, die BS-RNase, als RI-evasiv und zytotoxisch erwiesen. Ähnlich verhielten sich artifizielle RNase A-Aggregate, bei denen durch Austausch N- und/oder C-terminaler Bereiche des Proteinmoleküls (domain swapping) definierte Oligomere entstanden. Beide Kon­struktformen sind jedoch nur metastabil, d. h. sie dissoziieren unter physiologischen Bedingungen in Monomere, die effizient vom RI inhibiert werden.

In unserer Arbeitsgruppe wurden aus der nicht zytotoxischen RNase A durch Genduplikation pseudo-dimere Tandemenzyme generiert, bei denen zwei RNase A-Moleküle über einen Peptid-Linker kovalent miteinander verbunden sind (Abb. 3). Die RNase A-Einheiten können so nicht mehr dissoziieren und die Tandemenzyme sollten daher nicht RI-sensitiv reagieren. Durch Variation der Aminosäuresequenz des Peptid-Linkers (Länge, Ladung, Flexibilität) wurde zudem versucht, die Eigenschaften der Tandemkonstrukte zu modulieren. Tatsächlich zeigten die Tandemenzyme mit IC50-Werten von 13-70 µM eine deutliche Zytotoxizität, wobei sich die Variante mit dem höchsten Anteil basischer Aminosäuren in der Linker-Sequenz als am effektivsten erwies [8]. Die Analyse der Aufnahme und der intrazellulären Verteilung der Tandemenzyme in Tumorzellen zeigte eine verbesserte Internalisierung gegenüber RNase A, die als Ursache für ihre Zytotoxizität anzunehmen ist [9]. Da RNasen über elektrostatische Interaktionen an die Zellmembran binden, zeigen generell Varianten mit erhöhter positiver Ladung eine gesteigerte Zytotoxizität. Eine umfangreiche Analyse des Inaktivierungsverhaltens und der Bindungsstöchiometrie im Komplex RNase A-Tandemenzym•RI ergab, dass t ein 1:1-Komplex vorliegt, die Bindung eines RI-Moleküls in vitro jedoch beide aktive Zentren im Tandemenzym blockiert. Die Kristallisation und Aufklärung der Raumstruktur diente als Grundlage für Computermodellierungen, die die postulierte Bindung des RI an die N-terminale RNase A-Einheit der Tandemenzyme stützen. Die proteolytische Fragmentierung des RNase A-Tandemenzym•RI-Komplexes erbrachte die experimentelle Bestätigung dieses Postulats [10].

Die Erhöhung der positiven Nettoladung, ein clustering positiv geladener Aminosäurereste auf der Moleküloberfläche und/oder die Konjugation der RNasen mit Komponenten zur Erhöhung der Endozytoseeffizienz und/oder RI-Evasion stellen gegenwärtige Trends dar und weisen den Weg für eine weitere Optimierung von auf RNasen basierenden Tumortherapeutika [11].

Danksagung an:

Dr. Franziska Leich, Dr. Jens Köditz, Dr. Cindy Schulenburg,
Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Literatur

[1] http://www.who.int/cancer/en/

[2] http://www.bmg.bund.de/

[3] Ledoux L.: Nature 176, 36-37 (1955)

[4] Schulenburg C. et al.: Cancer Biol. Ther. 6, 1233-1239 (2007)

[5] Rutkoski T. J. et al.: J. Mol. Biol. 354, 41-54 (2005)

[6] Arnold U. und Ulbrich-Hofmann R.: Biotechnol. Lett. 28, 1615-1622 (2005)

[7] Arnold U.: Curr. Pharm. Biotechnol. 9, 161-168 (2008)

[8] Leich F. et al.: J. Mol. Biol. 358, 1305-1313 (2006)

[9] Leich F. et al.: J. Biol. Chem. 282, 27640-27646 (2007)

[10] Arnold U. et al.: FEBS Journal, 278, 331-340 (2011)

[11] Lomax J. E. et al.: Methods Enzymol. 502, 273-290 (2012)

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