Virus-ähnliche Partikel des Murinen Leukämievirus

Eine neue Plattform für modulare Vakzinierung?

  • Abb. 1: Schematische Darstellung der hergestellten VLP. Die VLP sind aus den strukturgebenden Proteinen des MLV aufgebaut und können über eine Transmembrandomäne das Modell-Antigen OVA und/oder das Adjuvanz GM-CSF auf ihrer Partikeloberfläche verankern. „Nackte“ VLP, die keines der gewählten Proteine präsentieren, dienten als Kontroll-Partikel für alle Untersuchungen. Nicht-modulare VLP präsentieren entweder OVA oder GM-CSF auf ihrer Oberfläche. Modulare VLP präsentieren sowohl OVA als auch GM-CSF auf ihrer Oberfläche.Abb. 1: Schematische Darstellung der hergestellten VLP. Die VLP sind aus den strukturgebenden Proteinen des MLV aufgebaut und können über eine Transmembrandomäne das Modell-Antigen OVA und/oder das Adjuvanz GM-CSF auf ihrer Partikeloberfläche verankern. „Nackte“ VLP, die keines der gewählten Proteine präsentieren, dienten als Kontroll-Partikel für alle Untersuchungen. Nicht-modulare VLP präsentieren entweder OVA oder GM-CSF auf ihrer Oberfläche. Modulare VLP präsentieren sowohl OVA als auch GM-CSF auf ihrer Oberfläche.
  • Abb. 1: Schematische Darstellung der hergestellten VLP. Die VLP sind aus den strukturgebenden Proteinen des MLV aufgebaut und können über eine Transmembrandomäne das Modell-Antigen OVA und/oder das Adjuvanz GM-CSF auf ihrer Partikeloberfläche verankern. „Nackte“ VLP, die keines der gewählten Proteine präsentieren, dienten als Kontroll-Partikel für alle Untersuchungen. Nicht-modulare VLP präsentieren entweder OVA oder GM-CSF auf ihrer Oberfläche. Modulare VLP präsentieren sowohl OVA als auch GM-CSF auf ihrer Oberfläche.
  • Abb. 2: Wirkung von modularen VLP auf primäre Immunzellen. Inkubation von primären Immunzellen mit GMCSF-tragenden VLP resultiert in der Expansion CD11b+ Zellen ungeachtet dessen, ob GM-CSF alleine oder zusammen mit OVA auf den VLP präsentiert wird. Die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen wird signifikant verstärkt induziert, wenn die Zellgemische mit modularen VLP inkubiert wurden. Die durch das nicht-modulare Gemisch induzierte Proliferation OVA-spezifischer T-Zell fällt deutlich geringer aus.

Die Vorbeugung von Infektionskrankheiten stellt eine bemerkenswerte Herausforderung dar. Für einige Erreger, die lebensbedrohliche und schwer therapierbare Erkrankungen verursachen, konnten noch keine effizienten Impfungen entwickelt werden. Gleichzeitig würden manche verfügbare Impfstrategien von einer Optimierung ihrer Effizienz- und Sicherheitsprofile, also das Gewährleisten von langanhaltendem Schutz bei guter Verträglichkeit, und Herstellungsprozesse profitieren. Somit besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger Impfstrategien.

Bei modularen Vakzinen werden die zentralen Bestandteile eines Impfstoffs, das Antigen und Adjuvanz, physisch konjugiert. Es konnte gezeigt werden, dass dadurch die Immunogenität des Impfstoffs erheblich gesteigert werden kann. Ausschlaggebend dafür ist offenbar der gleichzeitige Kontakt der Antigen-präsentierenden Zelle (antigen presenting cell, APC) mit diesen beiden Komponenten. Die APCs werden vom Adjuvanz aktiviert und zur selben Zeit mit dem mitgelieferten Antigen beladen. Letzteres kann durch die Aktivierung effizienter aufgenommen, prozessiert und präsentiert werden. Schließlich kann dies in einer verstärkten Antwort des adaptiven Immunsystems resultieren [1].
In dem hier beschriebenen Projekt wurden Virus-ähnliche Partikel (virus-like particles, VLP) des Murinen Leukämievirus (MLV) als Plattform für modulare Vakzinierungen untersucht. Diese VLP besitzen kein eigenes Genom und keine viralen Oberflächenproteine. Somit sind sie weder infektiös noch in der Lage zu replizieren. Für dieses Projekt wurden Partikel hergestellt, die aus den strukturgebenden Proteinen des MLV aufgebaut sind und sowohl Antigen als auch Adjuvanz jeweils fusioniert an eine Transmembrandomäne auf ihrer Oberfläche präsentieren (Modell in Abb. 1).
Mit diesen Partikeln werden zwei Faktoren kombiniert, die zu einer verstärkten Immunogenität beitragen können: Zum einen die gleichzeitige Präsentation von Antigen und Adjuvanz, zum anderen die partikuläre Struktur der VLP. Zudem bietet die Herstellungsweise der hier untersuchten VLP die Möglichkeit eines einfachen Austauschs von Antigen und/oder Adjuvanz. Dadurch können sowohl Spezifität als auch Wirkungsweise dieser Plattform schnell verändert werden.
In dieser Studie wurden die VLP mit Ovalbumin (OVA) als gut etabliertem Modell-Antigen und dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) als „nicht-klassischem“ Adjuvanz bestückt.

GM-CSF ist ein endogenes Zytokin, dessen Rezeptor u. a. auf myeloiden Immunzellen exprimiert wird, zu welchen auch dendritische Zellen (dendritic cells, DC), eine der wichtigsten Gruppen der APC, gehören. DC präsentieren Antigene auf dem Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) und können so Antigen-spezifische T-Zellen aktivieren. Somit sind DC die zentrale Schnittstelle zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem. Das gezielte Ansteuern dieser Zellen kann die Effizienz von Impfstoffen maßgelblich verbessern [2]. Zudem induziert das von uns gewählte Adjuvanz GM-CSF die Differenzierung und Proliferation der DC, was somit auch zur Verstärkung einer Immunantwort beitragen kann.

Die Wirkung von modularen VLP auf primäre Immunzellen
Um die biologische Aktivität des auf VLP präsentierten GM-CSF zu bestätigen, wurden undifferenzierte murine Knochenmarkszellen als Quelle für APC-Vorläuferzellen mit GM-CSF-präsentierenden VLP inkubiert. Ungeachtet dessen, ob GM-CSF alleine oder zusammen mit OVA auf den Partikel präsentiert wurde, konnte die Differenzierung und Expansion von Zellen erreicht werden, die den myeloiden Oberflächenmarker CD11b exprimieren, was eine von GM-CSF zu erwartende Stimulation dieser Zellen bestätigt. Die so nachgewiesene biologische Aktivität von GM-CSF auf VLP wurde auch in murinen Milz-Zellkulturen beobachtet. Dieses sekundäre lymphoide Organ setzt sich aus einer Vielzahl an Immunzellen zusammen (u. a. auch DC, deren Vorläufer und T-Zellen) und Milz-Zellkulturen wurde daher für folgende Experimente verwendet.
Um den nächsten Schritt einer Immunantwort gewährleisten zu können, müssen DC, die mit Hilfe modularer VLP gleichzeitig durch GM-CSF differenziert und mit OVA beliefert wurden, in der Lage sein, Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren. Die Frequenz solcher OVA-spezifischen T-Zellen naiver Mäusen liegt bei 1:10.000 bis 1:100.000 des gesamten T-Zell-Repertoires [3], wodurch endogene Antigen-spezifische T-Zell-Antworten kaum messbar sind. Aus diesem Grund wurden Milz-Zellkulturen transgener Mäuse genutzt (OT-I- und OT-II-Mäuse), die OVA-spezifische T-Zell Rezeptoren (T cell receptors, TCRs) auf allen T-Killerzellen (TK) bzw. T-Helferzellen (TH) exprimieren. Nach Stimulation von Mischkulturen aus OT-I- und OT-II-Milzzellen konnte gezeigt werden, dass modulare VLP, die GM-CSF und OVA ko-präsentieren, TK und TH aktivieren und deren Proliferation in ko-Kultur induzieren. Die Effekte eines äquimolaren Gemisches aus nicht-modularen VLP, die nur GM-CSF oder OVA präsentieren, waren bedeutend geringer (Abb. 2). Diese Untersuchungen bestätigen, dass die hier hergestellten VLP eine potentielle modulare Vakzin-Plattform darstellen.
Die Untersuchung der VLP in separaten OT-I- und OT-II-Milz-Zellkulturen konnte darüber hinaus weitere Hinweise auf die Wirkungsweise der Partikel liefern. Da die VLP nicht infektiös sind ist zu erwarten, dass sie durch Phagozytose aufgenommen werden und Peptide des assoziierten Antigens nach Prozessierung im Endosom hauptsächlich auf MHC Klasse II präsentiert werden, die wiederum für die Stimulation von TH zuständig sind. In der Tat konnte keine Aktivierung OVA-spezifischer TK durch die modularen VLP detektiert werden. Somit konnte zumindest in vitro auch keine nennenswerte Kreuz-Präsentation des extrazellulär gelieferten Antigens auf MHC Klasse I, die TK stimulieren würde, nachgewiesen werden. OVA-spezifische TH jedoch zeigten starke Aktivierung und Proliferation nach Inkubation mit modularen VLP in den Milz-Zellkulturen. Auch hier war der Effekt der modularen Partikel im Vergleich zu einem äquimolaren, nicht-modularen Gemisch signifikant erhöht.

Zusammenfassung
Diese Ergebnisse zeichnen folgendes Bild: Die modularen VLP werden als extrazelluläres Antigen von APC aufgenommen, die möglicherweise durch das Antigen GM-CSF angesteuert und definitiv zur Proliferation animiert werden. Das mitgelieferte Antigen OVA wird endosomal prozessiert und auf MHC Klasse II präsentiert. Dadurch werden vor allem Antigen-spezifische TH aktiviert, welche wiederum in der Lage sind, TK gleicher Spezifität zu aktivieren.
Zukünftige Experimente im murinen Tiermodell sollen die Effizienz und das protektive Potenzial der modularen VLP als Impfstoff verifizieren. Wenn dies gelingt, stellen die hier generierten VLP eine attraktive Plattform für modulare Vakzinierungsstrategien dar. Durch das „Baukastenprinzip“, was den rapiden Austausch von Antigen/Adjuvanz-Komposition auf demselben VLP-Rückgrat ermöglicht, könnten maßgeschneiderte Vakzine gegen eine Vielzahl von Pathogenen entwickelt werden.

Autoren
Patricia Gogesch1,2, Michael D. Mühlebach1, Zoe Waibler1

Zugehörigkeit
1Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland
2aktuell: Universitätsmedizin der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz, Institut für Virologie, Mainz, Deutschland

Kontakt  
Prof. Zoe Waibler

Paul-Ehrlich-Institut
Langen, Deutschland
Zoe.waibler@pei.de

Weitere Artikel zu Life Sciences & Biotechnologie
http://bit.ly/GIT-Biotech

Referenzen:

[1] Schülke, Stefan; Wolfheimer, Sonja; Gadermaier, Gabriele; Wangorsch, Andrea; Siebeneicher, Susanne; Briza, Peter et al. (2014): Prevention of intestinal allergy in mice by rflaA:Ova is associated with enforced antigen processing and TLR5-dependent IL-10 secretion by mDC. In: PloS one 9 (2), e87822. DOI: 10.1371/journal.pone.0087822.

[2] Yin, Wenjie; Gorvel, Laurent; Zurawski, Sandra; Li, Dapeng; Ni, Ling; Duluc, Dorothée et al. (2016): Functional Specialty of CD40 and Dendritic Cell Surface Lectins for Exogenous Antigen Presentation to CD8(+) and CD4(+) T Cells. In: EBioMedicine 5, S. 46–58. DOI: 10.1016/j.ebiom.2016.01.029.

[3] Jenkins, Marc K.; Moon, James J. (2012): The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. In: Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 188 (9), S. 4135–4140. DOI: 10.4049/jimmunol.1102661.

[4] Gardner, Thomas A.; Elzey, Bennett D.; Hahn, Noah M. (2012): Sipuleucel-T (Provenge) autologous vaccine approved for treatment of men with asymptomatic or minimally symptomatic castrate-resistant metastatic prostate cancer. In: Human vaccines & immunotherapeutics 8 (4), S. 534–539. DOI: 10.4161/hv.19795.

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