11.01.2013
ForschungUmwelt

ELISA goes Berlin

Bestimmung von Carbamazepin, Cetirizin und Coffein in Berliner Gewässern

  • Abb. 1: Verbreitung von Carbamazepin im Berliner Stadtgebiet (ELISA-Ergebnisse von Juli 2008 - Juli 2010)Abb. 1: Verbreitung von Carbamazepin im Berliner Stadtgebiet (ELISA-Ergebnisse von Juli 2008 - Juli 2010)
  • Abb. 1: Verbreitung von Carbamazepin im Berliner Stadtgebiet (ELISA-Ergebnisse von Juli 2008 - Juli 2010)
  • Abb. 2: Koffein und Carbamazepin in der Spree und in ihrem Seitenarm Rummelsburger See.
  • Schritte beim ELISA: Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte werden mit einem (sog. „sekundären“, Hilfs-) Antikörper beschichtet, der danach die analytspezifischen („primären“) Antikörper effizient bindet. Im 3. Schritt konkurrieren ein, dem Analyt nachempfundener, Enzym-Tracer mit dem Analyten aus der Probe (bzw. aus dem Kalibrierstandard) um die begrenzte Zahl an Antikörperbindungsstellen. Nach einem Waschschritt, der überschüssige Enzymmoleküle entfernt (Schritt 4), wird im 5. Schritt das Enzymsubstrat zugefügt, welches vom immobilisierten Enzym umgesetzt wird. Durch den Kompetitionsschritt ist die entstehende Farbintensität indirekt proportional zur Analytkonzentration in der Kavität. Ein Durchlauf dauert ca. 1,5 h und liefert zusätzlich zur Kalibration Ergebnisse für 25 Proben in Dreifachbestimmung.
  • Abb. 3: Oben: Cetirizin im Ablauf des Klärwerks Waßmannsdorf und im Teltowkanal. Konzentrationen sind als Verhältnis zur CBZ-Konzentration normalisiert. Unten: Häufigkeit von mittleren und hohen Pollenkonzentrationen in Zehntagesperioden in Pollenfallen in und um Berlin.
  • Dr. José João Dias Carvalho, Regulatory Affairs – Agrochemicals & Biocides Dr. Knoell Consult
  • Dipl.-Chem. Arnold Bahlmann, Helmholtz Zentrum für Umweltforschung UFZ Department Wirkungsorientierte Analytik

Sensitive und selektive Immunoassays unterstützen Untersuchungen im Vollzug der EU Wasserrahmenrichtlinie. Sie erlauben, eine hohe Anzahl von Proben ohne Anreicherungsschritte zu untersuchen und ermöglichen daher den Aufbau eines zeitlich und räumlich engmaschigen Messnetzes. Mit Hilfe von ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) wurde ein Gewässerscreening in Berlin durchgeführt.

Pharmaka in der Umwelt

In der letzten Dekade wurde eine große Anzahl pharmazeutischer Wirksubstanzen in Gewässern nachgewiesen [1]. Inzwischen kann man die auftretenden Konzentrationen für viele Stoffe überblicken und es wird angenommen, dass diese für den Menschen pharmakologisch bzw. toxikologisch nicht relevant sind.

Anders sieht die Situation für wasserbewohnende Lebewesen aus, die ggf. einer chronischen Belastung mit beispielsweise auch in sehr geringen Konzentrationen hormonell wirksamen Verbindungen ausgesetzt sind. Da manche Substanzen ubiquitär auftreten, d.h. in nahezu allen Gewässerproben mit anthropogenen Einträgen vorzufinden sind, liegt es nahe, einige als Markersubstanzen für die Anwesenheit des Menschen, und damit seiner Ausscheidungen ins (Ab-) Wasser, zu betrachten.

ELISA als Screening-Methode

Der Wunsch, sich von den Konzentrationsvariationen solcher Marker ein exaktes Bild zu machen, erfordert eine große Anzahl von Probenahmeorten und ein zeitlich engmaschiges Monitoring. Mit den konventionellen Analyseverfahren, insbesondere LC-MS/MS [2] lassen sich solche Großserien nur mit hohem finanziellen Aufwand bewältigen.

Immunoassays, insbesondere der weit verbreitete Assay-Typ ELISA, sind eine schnelle, kostengünstige und nachweisstarke Alternative. Die fehlende Notwendigkeit einer Probenanreicherung macht sie besonders für das High- Throughput-Screening interessant. Sie können daher bestens für das Monitoring beim Vollzug der EU Wasserrahmenrichtlinie Verwendung finden. Die Arbeitsschritte beim sog. direkten ELISA sind im Schema (Kasten) dargestellt.

Bei der Suche nach geeigneten Reagenzien für diese antikörperbasierten Nachweisverfahren kommt dem Entwickler zugute, dass für viele der Pharmazeutika, die es als „pollutants of emerging concern“ zu überwachen gilt, käufliche Antikörper existieren.

Wir benutzten monoklonale (Anti-)Koffein- Antikörper für den Aufbau eines sensitiven ELISAs [3] für Abwasser-, Oberflächengewässerund Trinkwasserproben. Der Test funktioniert aber auch hervorragend für die Bestimmung von Koffein (CAF) in koffeinhaltigen Getränken [4].

Koffein ist als Marker für ungeklärtes Abwasser geeignet, da es dort in recht hohen Konzentrationen auftritt, aber während der Klärwerkspassage fast vollständig abgebaut wird. Mit einem Antikörper, der zur Bestimmung von Serumkonzentrationen des Antiepileptikums Carbamazepin (CBZ) entwickelt wurde [5], gelang uns der Aufbau eines „dual analyte“ Immunoassays.

Dabei ließ sich durch eine pH-abhängige Selektivitätssteuerung des Antikörpers [6] sowohl Carbamazepin als auch Cetirizin (CET) quantifizieren [7]. Während CBZ in Kläranlagen kaum abgebaut wird und daher als Marker für eine Gewässerbeeinflussung durch Abwasser diskutiert wird [8], ist Cetirizin, ein Antihistaminikum, das v.a. saisonal auftritt [9].

Berliner Gewässerscreening

In den Jahren 2008 – 2010 wurde mit diesen Immunoassays von uns in Berlin ein Gewässerscreening durchgeführt [10]. Der Eintrag von abwasserbürtigen Spurenstoffen in die Berliner Gewässer ließ sich mit Hilfe des Markers CBZ anschaulich zeigen. Die beiden Hauptfließgewässer Berlins, Spree und Havel, waren vor dem Eintritt ins Stadtgebiet mit weniger als 0,1 μg / l CBZ sehr gering belastet (Abb.1).

Durch den Eintrag von Abwasser aus der Kläranlage stieg der CBZ-Gehalt im Tegeler See, der zur Havel-Oder-Wasserstraße gehört, auf über 0,7 μg / l deutlich an. Ein ähnlicher Einfluss der Einleitung behandelten Abwassers ist im Neuenhagener Mühlenfließ und am Teltowkanal beobachtbar. Bedingt durch die Klärwassereinleitung wurden hier vergleichsweise hohe Konzentrationen zwischen 1 und 2 μg / l gemessen.

Nach der Passage durch das Berliner Stadtgebiet wurde an der Unterhavel eine erhöhte CBZ-Konzentration von 0,8 μg / l erhalten, die CBZ-Konzentration in der Havel hatte sich damit während der Passage durch das Berliner Stadtgebiet verzwanzigfacht. Diese Ergebnisse zeigen, dass der menschliche Eintrag in die Gewässer über den Marker CBZ sehr deutlich nachweisbar ist. Der Weg des Abwassers vom Klärwerk in das Oberflächengewässer sowie der weitere Verlauf lassen sich gut nachvollziehen.

Die ELISA-Technik kann ebenfalls benutzt werden, um die räumliche Verteilung von Kontaminanten zu untersuchen und somit mögliche Punktquellen zu identifizieren. Die erhöhten Koffein-Konzentrationen im Rummelsburger See, einem Seitenarm der Spree, können hierfür als Beispiel dienen. Bei der Untersuchung von 31 Wasserproben wurden in dieser Bucht deutlich erhöhte Koffeinkonzentrationen von bis zu 0,36 μg / l gefunden (Abb. 2).

In der angrenzenden Spree waren die Konzentrationen um den Faktor 4 geringer. Die gleichzeitig konstant niedrigen CBZ-Konzentrationen zeigen, dass nur ungeklärtes Abwasser, nicht aber geklärtes Abwasser als Quelle in Frage kommt. Dieses Rohabwasser kann z. B. durch Exfiltration aus maroden Kanalisationssystemen stammen.

Die häufige Beprobung mit dem ELISA kann darüber hinaus helfen, saisonale Schwankungen im Vorkommen der Arzneimittel in Gewässern zu identifizieren. Wie Koffein und Carbamazepin wurde auch das Antihistaminikum Cetirizin sehr häufig in den Berliner Gewässern gefunden. Die höchsten Konzentrationen traten dabei während der Heuschnupfenzeit zwischen März und August auf.

Die Cetirizin-Konzentrationen ließen sich mit dem saisonalen Auftreten von Pollen korrelieren (Abb. 3). Antikörper und weitere benötigte Immunreagenzien (Enzymkonjugate) können zu Forschungszwecken von der BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung bezogen werden (siehe Kontakt).

Schritte beim ELISA:

Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte werden mit einem (sog. „sekundären“, Hilfs-) Antikörper beschichtet, der danach die analytspezifischen („primären“) Antikörper effizient bindet. Im 3. Schritt konkurrieren ein, dem Analyt nachempfundener, Enzym-Tracer mit dem Analyten aus der Probe (bzw. aus dem Kalibrierstandard) um die begrenzte Zahl an Antikörperbindungsstellen.

Nach einem Waschschritt, der überschüssige Enzymmoleküle entfernt (Schritt 4), wird im 5. Schritt das Enzymsubstrat zugefügt, welches vom immobilisierten Enzym umgesetzt wird. Durch den Kompetitionsschritt ist die entstehende Farbintensität indirekt proportional zur Analytkonzentration in der Kavität. Ein Durchlauf dauert ca. 1,5 h und liefert zusätzlich zur Kalibration Ergebnisse für 25 Proben in Dreifachbestimmung.

Literatur

[1] Daughton C.G. and Ternes T.A.: Environ Health Persp 107, 907–938 (1999)

[2] Ternes T.A.: TRAC – Trends Anal Chem 20, 419–434 (2001)

[3] Carvalho J.J. et al.: Anal Bioanal Chem 396, 2617– 2628 (2010)

[4] Carvalho J.J.D.: Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, 2011 http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/carvalhojose- joao-2011-04-12/PDF/carvalho.pdf

[5] Bahlmann A. et al.: Anal Bioanal Chem 395, 1808– 1820 (2009)

[6] Bahlmann A.: Dissertation, Humboldt-Universität Berlin, 2012

[7] Bahlmann A. et al.: Analyst 136, 1357–1364 (2011)

[8] Clara M. et al.: Water Res 38, 947–954 (2004)

[9] Calisto V. et al.: Chemosphere 84, 1708–1715 (2011)

[10] Bahlmann A. et al.: Chemosphere (2012), eingereicht Autoren Dipl.-Chem. Arnold Bahlmann, Helmholtz Zentrum für Umweltforschung UFZ Department Wirkungsorientierte Analytik Dr. José João Dias Carvalho, Regulatory Affairs - Agrochemicals & Biocides Dr. Knoell Consult

 

Autor(en)

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BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung
Rich-Willstätter-Str 11
12489 Berlin

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