16.03.2016
ForschungUmwelt

Gewinnung mikrobieller Glykolipide für Biokosmetika

Bioertifizierbare Biotenside und Wirkstoffe für Kosmetika

  • Abb. 1: Strukturformeln der beiden untersuchten mikrobiellen Glykolipide Mannosylerythritollipid (A) und Cellobioselipid (B), die von pflanzenassoziierten Pilzen gebildet werden.Abb. 1: Strukturformeln der beiden untersuchten mikrobiellen Glykolipide Mannosylerythritollipid (A) und Cellobioselipid (B), die von pflanzenassoziierten Pilzen gebildet werden.
  • Abb. 1: Strukturformeln der beiden untersuchten mikrobiellen Glykolipide Mannosylerythritollipid (A) und Cellobioselipid (B), die von pflanzenassoziierten Pilzen gebildet werden.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung des untersuchten biozertifizierbaren Prozesses.
  • Abb. 3: Herstellung von Cellobioselipiden im einfachen 10L-Glasreaktor (A). Der entstehende Schaum kann abgeführt werden und besteht aus nadelförmigen Kristallen und wenigen mitgeführten Zellen (B).
  • Abb. 4: Untersuchung der zytotoxischen Wirkung der Biotenside und ihrer Derivate in in vitro Assays mit Fibroblastenzellen.
  • Tab. 1: Vergleichende Bewertung verschiedener Zuckerquellen für Wachstum und MEL-Synthese von Stämmen der Gattung Pseudozyma. Sie wurden in Kombination mit ölhaltigen Resten aus der Olivenölherstellung als Substrate eingesetzt.
Im Bereich der Biokosmetika besteht eine stetig wachsende Nachfrage nach natürlichen grenzflächenaktiven Molekülen als Ersatz für synthetische Tenside. Mikrobielle Biotenside könnten diese Lücke füllen. In diesem Projekt wurden biozertifizierbare Verfahren zur Herstellung der mikrobiellen Glykolipide Cellobioselipid und Mannosylerythritollipid entwickelt unter Betrachtung der gesamten Prozesskette vom Rohstoff zum Produkt. 
 
Biotenside als neue Grundstoffe für Biokosmetika
Zusätze aus petrochemisch hergestellten Inhaltsstoffen in Kosmetikartikeln werden von Verbrauchern zunehmend kritisch betrachtet. Dies führt aktuell zu einer stetig steigenden Nachfrage nach Natur- bzw. Biokosmetika. Die Produktpalette und die Vielfalt der Naturprodukte sind allerdings durch einen Mangel an biozertifizierten Inhaltsstoffen begrenzt. Besonderer Bedarf besteht in Bezug auf biozertifizierbare Tenside, die als grenzflächenaktive Moleküle für die reinigende Wirkung von Shampoos und Seifen verantwortlich sind und als Emulgatoren Cremes und Lotionen stabilisieren. 
 
Tenside aus nachwachsenden Rohstoffen sind zwar bereits kommerziell erhältlich, jedoch handelt es sich größtenteils um Moleküle, die durch chemische Umsetzung von tropischem Kokos- oder Palmöl gewonnen werden. Diese Rohstoffe werden ökologisch kontrovers diskutiert und sind für Naturkosmetika ungeeignet. Eine Alternative stellen mikrobielle Biotenside dar, natürliche grenzflächenaktive Moleküle, die fermentativ mit Mikroorganismen hergestellt werden können. Trotz einiger Fortschritte bei der Kommerzialisierung der Biotenside in den letzten Jahren, ist ihre Herstellung immer noch vergleichsweise kostenintensiv. Außerdem wurden die etablierten Herstellungsprozesse in der Regel nicht unter dem Gesichtspunkt der biologischen Zertifizierbarkeit betrachtet. Die verwendeten Rohstoffe und Aufarbeitungsverfahren sind in dieser Hinsicht nicht zulassungsfähig.
 
Damit Biotenside auch für die Naturkosmetik lukrativ werden, entwickelte das Fraunhofer IGB im Projekt »O4S: Sustainable surfactant production from renewable resources through natural fermentation for applications in natural, organically-certified products« einen nachhaltigen, kostensenkenden und zertifizierbaren Herstellungsprozess, der die biotechnologische Fermentation und die Aufarbeitung der Biotensidprodukte umfasst.

Innerhalb des Projektes konzentrierte sich das Fraunhofer IGB auf die Biotenside Mannosylerythritollipid (MEL) und Cellobioselipid (CL), die von pflanzenassozierten Pilzen gebildet werden. In Kooperation mit Projektpartnern wurden die aufgearbeiteten Biotenside in kosmetischen Formulierungen getestet. Da die meisten mikrobiellen Glykolipide gleichzeitig antimikrobielle Wirkung zeigen, wurde untersucht, ob ein zusätzlicher Nutzen der ausgewählten Moleküle als antimikrobielle Wirkstoffe und Konservierungsmittel in der Produktformulierung erkennbar ist. Auch als Konservierungsmittel werden oft synthetische Zusätze verwendet, die durch natürliche Produkte aus nachwachsenden Rohstoffen ersetzt werden können. 

 
Zertifizierbarer Herstellungsprozess vom Rohstoff bis zum biobasierten Produkt
Ziel des Projektes war die Etablierung einer vollständig zertifizierbaren Prozesskette, mit der nachwachsende Rohstoffe aus ökologisch kontrolliertem Anbau mittels umweltfreundlicher Verfahren für die Herstellung von biobasierten Emulgatoren und Detergenzien verwendet werden, um diese in biozertifizierten Kosmetika einzusetzen. Um Biotenside als 100 Prozent kontrolliert »biologisch« bzw. »ökologisch« (englisch: organic) ausweisen zu können, muss sichergestellt werden, dass sowohl die eingesetzten Reststoffe aus der ökologischen Landwirtschaft als auch die Verfahren zur Rohstoffaufbereitung für die Herstellung von zertifizierbaren Biotensiden geeignet sind. Ebenso müssen für die Abtrennung und Aufreinigung der biotechnisch hergestellten Biotenside sowie für ihre Formulierung und Stabilisierung ökologisch tragbare Verfahren entwickelt und umgesetzt werden. Um geeignete Produktformulierungen entwickeln zu können wurden die anwendungsrelevanten Eigenschaften in Zusammenarbeit mit Forschungs- und Industriepartnern bestimmt. Dazu gehörte die Oberflächenaktivität, Schaumbildung, Löslichkeit und pH-Stabilität, sensorische Eigenschaften wie Farbe und Geruch und biologische Eigenschaften wie die antimikrobielle Wirkung und die Wirkung auf humane Hautzellen. 
 
Herstellung der zertifizierbaren Biotenside
Um auch in der fermentativen Herstellung die Bio-Kriterien zu erfüllen wurden verschiedene Wildtypstämme verwendet (nicht GMO). Im ersten Schritt wurden als Substrate für das Zellwachstum und zur Produktbildung ausreichend verfügbare Reststoffe selektiert. Dazu gehörten unter anderem Getreidespelzen und Nebenprodukte der Pflanzenölherstellung. Unter Verwendung optimierter Substratkombinationen wurde sowohl das Zellwachstum als auch die Biotensidbildung mit den ausgewählten Stämmen getestet. Für die Herstellung der beiden Biotenside eignen sich sowohl zuckerhaltige Substrate als auch Öle und Fettsäuren. Eine Kombination beider Rohstoffe fördert beispielsweise eine besonders effektive MEL-Synthese. 
 
Es stellte sich heraus, dass Nebenprodukte der Ölivenölgewinnung besonders hohe MEL-Konzentrationen ermöglichen, vergleichbar mit herkömmlichen Pflanzenölen. Um das Zellwachstum zu verstärken wurde dieser Reststoff mit unterschiedlichen Zuckerquellen kombiniert und mit der Zugabe von reiner Glukose verglichen (Tab. 1). Die Zugabe von konzentriertem Most, Bioglycerin und Biomelasse als Zuckerquellen zeigten ähnliche Biomassekonzentrationen wie die Verwendung von reiner Glukose. Auch Zucker aus dem Aufschluss von Lignozellulose ermöglichten nach vorheriger Verdünnung der Aufschlusslösung, einen hohen Zuwachs an Biomasse. Höher konzentrierte Aufschlusslösungen enthielten zu hohe Anteile von inhibierenden Abbauprodukten wie Ameisen- und Levulinsäure und inhibierten das Zellwachstum. Hier wäre eine Detoxifizierung der Zuckerlösung durch Entfernung der störenden Inhibitoren nötig.
 
Parallel zur Fermentationsoptimierung wurde eine Strategie für die Abtrennung und Aufarbeitung der Biotenside entwickelt. Dazu wurden Sedimentations-, Extraktions und Membranfiltrationsverfahren getestet und sequentiell eingesetzt. Die strengen Kriterien erlaubten hierbei nur den Einsatz von ausgewählten, nichttoxischen Biolösungsmittel wie beispielsweise Bioethanol. Die Versuche zeigten, dass über Sedimentation und Extraktion die Gewinnung der Glykolipide aus der Fermentationssuspension mit einer Ausbeute von über 90 % möglich ist. Entscheidend war dabei die Wahl des richtigen Zeitpunktes zum Beenden der Fermentation, der bei einer möglichst kurzen Fermentationsdauer, eine hohe Produktkonzentration und einen geringen Restkonzentration des eingesetzten Substrates ermöglicht. So sind zusätzliche Aufarbeitungsschritte zur Abtrennung der Substrate nicht erforderlich. Im optimierten Verfahren konnte eine maximale Produktkonzentration von 100 g/L und ein Aufreinigungsgrad von 95 % im Rohextrakt erreicht werden. 
 
Für die Synthese der Cellobioselipide wurde nur Zucker als Kohlenstoffquellen eingesetzt. Bei der Fermentation zur Herstellung dieses Glykolipids kam es zu einer intensiven Schaumbildung (Abb. 3A). Dieser Schaum enthielt einen Großteil des Glykolipids in kristalliner Form und konnte im Kopfraum des Reakors abgeführt werden. So wird eine in situ Produktabführung ermöglicht mit der eine Produktinhibition verzögert werden kann. Gleichzeitig erhält man nach Kollabieren des Schaumes eine bereits konzentrierte Produktsuspension. Die entstehenden nadelförmigen Kristalle (Abb. 3B) können über Sedimentation von der Suspension separiert werden. In Bezug auf die Cellobioselipide wurde bisher eine maximale Konzentration von über 30 g/L erreicht.
 
Modifizierung und Charakterisierung der Glykolipide für kosmetische Produkte
Nach der Fermentation wurden die aufgearbeiteten Glykolipide einfachen zertifizierbaren Modifizierungsmethoden unterzogen, um die Eigenschaften gezielt zu beeinflussen 
 
Beispielsweise wurden durch eine alkalische Behandlung des produzierten Cellobioselipid-Gemisches, kurze hydrophobere Seitengruppen abgespalten, die zu hydrophileren Molekülen mit niedrigerem Molekulargewicht führten (Abb. 4A/B). Neben eine Erhöhung der Löslichkeit zeigten Zytotoxtests mit humanen Zellen eine Senkung der Zytotoxizität durch die alkalische Behandlung um ein Vielfaches (Abb. 4C). So entstand ein sehr mildes Tensid, das sich sehr gut für kosmetische Produktformulierungen eignete. Um die zur Verfügung stehenden Biotenside optimal einsetzen zu können, wurden auf Basis der Charakterisierung eine Formulierungsplattform entwickelt, die zu ersten Demonstrationsprodukten führte. Schließlich liefert die Systembetrachtung unter Berücksichtigung der gesamten Massen- und Energiebilanz ein Konzept zur industriellen Auslegung und Umsetzung des integrierten Prozesses.
 
Förderung
Wir danken der Europäischen Kommission für die Förderung des Projekts »O4S: Sustainable surfactant production from renewable resources through natural fermentation for applications in natural, organically-certified products«, Förderkennzeichen 286859.
 
Autoren
Michael Günther, Susanne Zibek
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB Abteilung Molekulare Biotechnologie, Stuttgart#
 
Kontakt
Dr.-Ing. Susanne Zibek
Diplomingenieurin Chemie 
und Technische Diplombiologin
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und 
Bioverfahrenstechnik IGB
Abteilung Molekulare Biotechnologie
Gruppenleiterin Industrielle Biotechnologie
Stuttgart
 
Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/

 

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