10.03.2020
ForschungUmwelt

Hochauflösende Massenspektrometrie

Identifizierung unbekannter organischer Mikroverunreinigungen im Rahmen eines Trinkwassergewinnungsprozess

  • Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatogramme von Metoprololsäure/Atenololsäure in den Proben a) Trinkwasser, b) Kläranlagenablauf und c) Referenzstandard (500 ng/L).Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatogramme von Metoprololsäure/Atenololsäure in den Proben a) Trinkwasser, b) Kläranlagenablauf und c) Referenzstandard (500 ng/L).
  • Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatogramme von Metoprololsäure/Atenololsäure in den Proben a) Trinkwasser, b) Kläranlagenablauf und c) Referenzstandard (500 ng/L).
  • Abb. 2: Fragmentionenspektren der Proben a) Trinkwasser, b) Kläranlagenablauf und c)  Referenzstandard (500 ng/L).

Mittels hochauflösender Massenspektrometrie können neben der Untersuchung von bekannten Mikroverunreinigungen auch unbekannte Substanzen in Wasserproben erfasst, charakterisiert und auch identifiziert werden. Des Weiteren können Prozesse, wie beispielsweise Trinkwasseraufbereitungsprozesse umfassend untersucht werden.

Die Analyse organischer Mikroverunreinigungen in Roh- und Trinkwässern ist ein wichtiger Bestandteil für die Überprüfung der Einhaltung der Trinkwasserqualität. In der Analytik werden üblicherweise flüssigchromatographische oder gaschromatographische Trennverfahren in Verbindung mit massenspektrometrischer Detektion angewandt. Diese Methoden weisen jedoch eine eingeschränkte Selektivität auf. Für ein Monitoring sind daher viele analytische Methoden erforderlich. Mit der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS), die eine höhere Selektivität aufweist als einheitsauflösende Massenspektrometer, besteht die Möglichkeit, umfassende Screening-Ansätze durchzuführen. Dabei kann eine Target-Untersuchung, ein Suspect-Screening oder Non-Target-Screening erfolgen. In der Target-Analytik werden bekannte Analyten mit Hilfe von Referenzsubstanzen quantifiziert. In einem Suspect-Screening werden Daten aus der Messung einer Probe mit einer Datenbank abgeglichen, die Einträge zu Substanzen enthält, die in der Probe erwartet werden können. Als wichtige Kriterien dienen dabei die Summenformel und damit verbundene exakte Masse, Fragmentionen und das Isotopenverhältnis. Damit können Substanzen in einer Probe vorläufig identifiziert werden. Je mehr Informationen eine Datenbank zu einer Substanz enthält desto mehr Daten können mit der Probe abgeglichen werden, was die Sicherheit der Identifizierung steigert. Eine eindeutige Identifizierung kann allerdings nur durch den Abgleich mit der entsprechenden Referenzsubstanz geschehen. In der Kopplung von HRMS mit der Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS), beispielsweise mit einer Traveling-Wave-IMS, können Kollisionsquerschnitte (CCS, engl. collision cross section) als zusätzliches Identifizierungskriterium genutzt werden. In einem Non-Target-Screening werden Peaks ohne weitere Information betrachtet. Dies kann dann beispielsweise für eine Prozessbewertung herangezogen werden [1].

Für die gefundenen Peaks wird häufig der Begriff Feature verwendet, welcher die Kombination aus dem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z), Retentionszeit, Intensität und ggf. CCS-Wert für einen Peak darstellt. Einzelne Features können aus den Listen priorisiert werden (z. B. anhand ihrer Intensitäten), welche dann im einfachsten Fall mit Hilfe von Datenbanken vorläufig und bei Verfügbarkeit von Referenzstandards und im Falle einer Übereinstimmung eindeutig identifiziert werden können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Identifizierung von Mikroverunreinigungen im Trinkwasser durch ein Non-Target-Screening mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Ionenmobilitäts-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-IM-Q-TOF-MS) durchgeführt. Das untersuchte Trinkwasser wird aus einer Talsperre gewonnen. Im Oberlauf des Talsperrenzuflusses erfolgen anthropogene Einträge von zwei Kläranlagen. Insgesamt wurden sechs Wasserproben (zwei Kläranlagenabläufe, ein Oberflächenwasser, ein Rohwasser, ein Prozesswasser und eine Trinkwasserprobe) auf organische Mikroverunreinigungen, untersucht.

Material und Methoden

Die Messungen wurden mit einer Acquity I Class UPLC Anlage gekoppelt an ein Vion IMS-QTof System (beides Waters) durchgeführt. Für die Chromatographie wurde eine HSS T3 (2,1 x 100 mm) 1,8 µm und eine BEH Amid Vorsäule (2,1 x 5 mm) 1,8 µm bei 40 °C verwendet. Die Elution erfolgte mit Wasser und Methanol (beide mit je 0,1% Ameisensäure versetzt). Zu Beginn war der Eluent 100 % wässrig (1 min). Der organische Anteil stieg von 0 % auf 99,0 % innerhalb von 14 min und wurde für 2 min gehalten. Anschließend wurde der Eluent wieder auf 100 % Wasser eingestellt. Ein Probevolumen von 100 µL wurde injiziert. Zur Ionisation wurde die Elektrosprayionisation (ESI) genutzt, wobei die Messungen im positiven und negativen Messmodus in getrennten Läufen durchgeführt wurden. Alle Messungen erfolgten innerhalb des Massenbereiches von 100 bis 1000 Da im HDMSE-Akquisitionsmodus. Low-energy-Spektren wurden bei 4 eV und high-energy-Spektren im Bereich von 15 bis 40 eV aufgenommen. Die CCS-Werte der Analyten wurden über eine vorherige Kalibration mit analytähnlichen Standards bestimmt. Zur Datenauswertung wurde die UNIFI 1.9.4 Software (Waters) genutzt. Im ersten Schritt wurde ein quantitatives Screening [2] von insgesamt 143 organischen Mikroverunreinigungen durchgeführt. In einem zweiten Schritt erfolgte ein Suspect-Screening mit Datenbanken, die zusammen mehr als 1500 Einträge beinhalten. Für das anschließende Non-Target-Screening wurden alle nicht identifizierten oder durch das Suspect-Screening nicht vorläufig identifizierten Peaks betrachtet. Zur weiteren Datenreduktion wurden Isotopenpeaks und Adduktpeaks zusammengeführt. Features, die auch in der Blankprobe (UPLC-Wasser) detektiert wurden, wurden aus den Featurelisten der Proben entfernt. Darüber hinaus wurden nur Features weiter betrachtet, die in allen Triplikatmessungen detektiert wurden. In einem nachfolgenden Schritt wurden die Features bestimmt, die als Schnittmenge in den Featurelisten der beiden Abwässer, des Oberflächenwassers, des Rohwassers, des Prozesswassers und in der Trinkwasserprobe auftraten. Ziel war es, die Substanzen genau zu untersuchen, die das Trinkwasser erreichen und nicht während der Aufbereitung entfernt werden. Die erhaltenen Features wurden manuell geprüft, um falsch positive Peaks zu vermeiden. Von den so erhaltenen Features wurden Summenformeln mit der Unifi-Software bestimmt, wobei nur Summenformeln, die ein i-fit-confidence ≥ 80 % ergaben, weiter betrachtet wurden. Features mit Treffern in der Open-Source-Datenbank For-Ident wurden priorisiert. Unter Verwendung der Kategorisierung von Schymanski et al. [3], wurden Treffer mit übereinstimmenden Fragmentspektren dann vorläufig identifiziert (Level 2) und mittels Referenzstandards (sofern vorhanden) eindeutig identifiziert (Level 1).

Ergebnisse

Die Featurelisten, die m/z, Retentionszeiten, CCS und Response-Werte beinhalten, wurden wie beschrieben prozessiert. Von insgesamt 2280 Features, die im ESI-positiv-Modus in der Trinkwasserprobe detektiert wurden, ergaben sieben Features Summenformeln mit einem i-fit-confidence ≥ 80 %. Bei den Messungen im ESI-negativ-Modus konnten ausgehend von 771 Features der Trinkwasserprobe von drei Features Summenformeln entsprechend bestimmt werden. Für das Feature aus den ESI positiv Daten mit der Summenformel C14H21NO4 ergab die Suche in der For-Ident-Datenbank einen Treffer für Metoprololsäure/Atenololsäure (Transformationsprodukt der beiden b-Blocker Metoprolol und Atenolol). Der Abgleich eines Referenzspektrum aus der Pubchem-Datenbank zeigte ebenfalls eine gute Übereinstimmung. Durch die Referenzsubstanz konnte Metoprololsäure/Atentololsäure in den Proben eindeutig identifiziert werden (Abb. 1 und 2). Bei der Auswertung der Daten aus den ESI negativ Messungen, ergab sich für ein Feature mit der ermittelten Summenformel C7H5NO3S2 ein Treffer in der For-Ident-Datenbank für 1,3-Benzothiazol-2-sulfonsäure, bekannt als Transformationsprodukt von Mercaptobenzothiazol, welches als Vulkanisationsbeschleuniger verwendet wird. Auch hier ergab der Vergleich mit einem Referenzspektrum aus der Pubchem-Datenbank eine gute Übereinstimmung. Der Referenzstandard war zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht verfügbar, daher konnte 1,3-Benzothiazol-2-sulfonsäure nur mit Level 2 kategorisiert werden.

Fazit

Mit dem beschriebenen Ansatz ist es möglich, neben den bekannten organischen Mikroverunreinigungen auch unbekannte zu erfassen und durch Priorisierung und Datenbanksuche zu identifizieren. Als Empfehlung sollte Metoprololsäure/Atenololsäure im Rahmen einer Target-Analytik zukünftig überwacht werden. Es wird weiterhin angestrebt die vorläufig identifizierte 1,3-Benzothiazol-2-sulfonsäure mittels Referenzstandard eindeutig zu charakterisieren.

 

Autoren

Vanessa Hinnenkamp1,2, Peter Balsaa1, Torsten C. Schmidt1,2

Zugehörigkeiten

1IWW Zentrum Wasser, Mülheim an der Ruhr

2Universität Duisburg-Essen, Instrumentelle Analytische Chemie und Zentrum für Wasser- und Umweltforschung, Essen

 

Literatur

[1] Bader T, Schulz W, Kümmerer K, Winzenbacher R. Anal. Chem. 2017, 89, 13219-13226. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b03037

[2] Hinnenkamp V, Balsaa P, Schmidt TC. Anal. Bioanal. Chem. 2019, 411, 6101-6110. DOI: doi: 10.1007/s00216-019-01994-w.

[3] Schymanski EL, Jeon J, Gulde R, Fenner K, Ruff M, Singer HP, Hollender J. Environ. Sci. Technol. 2014, 48, 2097-2098. DOI: 10.1021/es5002105

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