31.03.2011
ForschungUmwelt

HPTLC/AMD in Kombination mit Biolumineszenz-Detektion

  • Abb. 1: Schematischer Ablauf des Biolumineszenz-Tests auf der TLC-PlatteAbb. 1: Schematischer Ablauf des Biolumineszenz-Tests auf der TLC-Platte
  • Abb. 1: Schematischer Ablauf des Biolumineszenz-Tests auf der TLC-Platte
  • Abb. 2: Vergleich der Sensitivität des Leuchtbakterien-Tests am Beispiel von Bromoxynil  a) auf der TLC-Platte (links) und b) im Küvettentest (rechts)
  • Abb. 3: Vergleich der Untersuchungsergebnisse einer Deponiesickerwasserprobe hinsichtlich der Exposition (links) und der Wirkung auf Vibrio fischeri (rechts) sowie der AChE-Hemmung (Mitte)
  • Abb. 4: Detektion der Biolumineszenz-Hemmung nach HPTLC/AMD-Entwicklung (Auftragevolumen: 60 μl des TBME-Extraktes des Eluats der Elastikschicht): A: Aufnahme der Biolumineszenz; B: Gamma-Wert-Chromatogramm
  • Abb. 5: UV-Spektrum (A), HPLC-MS-Chromatogramm der extrahierten Bande (B) und das Isotopenmuster (C) der identifizierten Verbindung 2-Hydroxy-benzothiazol
  • Abb. 6: Untersuchung der Wirkung auf Vibrio fischeri von mit Röntgenkontrastmitteln belastetem Prozessabwasser bei der Behandlung mit UV-Licht

Der Eintrag von anthropogenen organischen Stoffen in die Umwelt stellt eine potenzielle Gefährdung der Rohwasserressourcen und somit auch des Trinkwassers dar. Ihr Vorkommen hängt u. a. von der Produktionsmenge, vom Anwendungsspektrum und dem Verhalten in der Umwelt ab. Industrie- und Haushaltschemikalien, Arzneimittel, Pflanzenschutzmittel (PSM) und deren Metabolite gehören zu den am häufigsten vorkommenden anthropogenen Stoffen in der aquatischen Umwelt [1-3]. Ihr Haupteintrag erfolgt je nach Anwendung direkt, wie beispielsweise durch Ausbringung von PSM, oder indirekt über die Kläranlagen, wie im Fall von Arzneimitteln und Haushaltschemikalien. Außerdem können organische Verunreinigungen über Altlasten oder Deponiesickerwasser sowie durch Unfälle in die Umwelt gelangen. Aus diesen Gründen ist es für einen Wasserversorger notwendig, die zur Trinkwassergewinnung genutzten Wasserressourcen regelmäßig und umfassend zu überwachen.

Mittels moderner physikalisch-chemischer Analysentechniken, wie der Gaschromatographie (GC) oder der Flüssigkeitschromatographie (LC) gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS), ist es heute möglich, Proben auf einige hundert Verbindungen simultan zu untersuchen. Diese klassischen Screening-Verfahren können nur Substanzen detektieren, die gezielt gesucht werden. Hierbei nicht berücksichtigte oder bisher noch unbekannte Substanzen bzw. Abbauprodukte werden mit diesen Methoden nicht erfasst. Eine Alternative stellt die Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie mit automatisierter Mehrfachentwicklung (HPTLC/AMD) und ihren unterschiedlichen Detektionsmöglichkeiten dar [4, 5, GIT-Tipp: HPTLC Symposium 2011]. Die Messung der Lichtabsorption bei unterschiedlichen Wellenlängen (Mehrwellenlängenscan, MWL) ist eine effektive Möglichkeit des Screenings auf unbekannte Substanzen. Doch liefert die Detektion mittels physikalisch-chemischer Verfahren keine Aussage über die Wirkungen der Substanzen. Diese können nur durch biologische Testverfahren ermittelt werden, wobei hier unter Anwendung der klassischen Methoden lediglich der Summeneffekt mehrerer Substanzen festgestellt werden kann.

Deshalb nutzt die Landeswasserversorgung (LW) neben der herkömmlichen Target-Analytik mittels physikalisch-chemischer Detektion die wirkungsbezogene Analytik (WBA) nach Trennung der Substanzen auf der HPTLC-Platte als Teil eines multidimensionalen Screenings zur Überwachung ihrer Rohwässer, um auf diese Weise auch die biologische Wirkung einzelner Substanzen oder Substanzgruppen bestimmen zu können.

Die WBA koppelt physikalisch-chemische Trennverfahren mit biologischen Testsystemen. Durch diese Kombination ist es möglich, Aussagen über die Probenzusammensetzung und die biologische Wirkung der Inhaltsstoffe zu erhalten. Als besonders erfolgreich hat sich bisher die HPTLC/AMD in Kombination mit der Biolumineszenz-Detektion unter Verwendung des Leuchtbakteriums Vibrio fischeri erwiesen [6-10].

Methodik

Allgemeines
Bei der HPTLC/AMD-Trennung erfolgt die Entwicklung der Platte grundsätzlich mehrfach. Dabei wird jeweils die Höhe der Laufstrecke vorher definiert. Nach Erreichen der jeweiligen Stufenhöhe wird das Fließmittel aus der Entwicklungskammer entfernt und die HPTLC-Platte unter Vakuum getrocknet. Anschließend wird die Platte mit einer neuen Fließmittelzusammensetzung auf die nächst höhere Stufe entwickelt. Die Mehrfachentwicklung in Kombination mit einer Gradientenelution führt zu einer Fokussierung der Banden und steigert damit die Trennleistung [4, 5]. Da es sich bei der HPTLC/AMD um ein offenes Trennsystem handelt, lassen sich verschiedenste Detektionsarten anwenden:
Alle UV/VIS-aktiven Substanzen können durch das Messen der Remission über die Laufstrecken der Proben mittels eines Mehrwellenlängenscans ortsabhängig erfasst werden. Auch ist die Aufnahme eines UV/VIS-Remissions- und Fluoreszenzspektrums der einzelnen Substanzen möglich (TLC-Scanner, Camag).

Durch Tauchen der entwickelten Platte in eine Leuchtbakterien-Suspension (Vibrio fischeri) können bioaktive Substanzen erkannt werden. Hierbei wird das von den Bakterien emittierte Licht in einer Dunkelkammer (Bioluminizer, Camag) detektiert. Die Substanzen, die eine toxische Wirkung auf den Stoffwechsel von Vibrio fischeri besitzen und dadurch die Biolumineszenz hemmen, erscheinen als dunkle Banden im digitalen Bild. Aus den Graustufen der Pixel des digitalen Bildes erfolgt eine Berechnung der Hemmwerte, die sich ortsaufgelöst als Hemmwert-Chromatogramm oder als Gamma-Wert-Chromatogramm ( Γ-Wert = Hemmung [%] / (100 - Hemmung [%] ) darstellen lassen [9]. Verschiedentlich werden auch Biolumineszenz-Intensivierungen beobachtet.

Substanzen aus einzelnen Banden können durch Extraktion von der Platte (TLC-MS Interface, Camag) der Massenspektrometrie zugänglich gemacht werden. Eine Identifikation der extrahierten unbekannten Verbindungen ist z.B. durch die Verwendung eines Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometers (QTOF-MS, Agilent oder AB Sciex) grundsätzlich möglich und auch bereits mehrfach gelungen [10-12].

Vergleich der Leuchtbakterientests in der Küvette und auf der TLC-Platte
Der nach DIN EN ISO 11348-1 (2009) [13] standardisierte Biotest mit Leuchtbakterien (Küvettentest) findet routinemäßig Anwendung in der Abwasserüberwachung. In Kläranlagen dient er unter anderem dazu, den Zulauf zu überwachen und die biologischen Reinigungsstufen vor toxischen Einleitungen zu schützen. Außerdem wird der Leuchtbakterien-Test schon seit längerer Zeit nach der Chromatographie und Trennung der Substanzen direkt auf der TLC-Platte angewandt (Abb. 1) [6-9].

Durch das im Betriebs- und Forschungslaboratorium der LW entwickelte Auswerteverfahren ist es möglich, die Stärke der Hemmung von Vibrio fischeri durch die auf der Platte getrennten Substanzen selektiv zu bestimmen. Um die beiden Testverfahren in Bezug auf ihre Sensitivität miteinander zu vergleichen, wurden mittels Konzentrationsreihen die Dosis-Wirkungsbeziehungen von Bromoxynil mit dem Küvettentest] und dem TLC-Test bestimmt (Abb. 2). Hierfür waren im TLC-Test unterschiedliche Volumina einer methanolischen Bromoxynil-Lösung auf quadratische Flächen aufzusprühen, dabei verdampfte das Lösemittel und hatte keinen Einfluss mehr auf die Biolumineszenz von Vibrio fischeri. Aufgrund der Flächenauftragung wird die Konzentration als Flächenmasse in ng / cm² angegeben. Für den Vergleich der Sensitivität wurde die Konzentration, die im Küvettentest notwendig ist, um die gleiche Hemmung wie im TLC-Test zu erreichen, gegen die Flächenmasse auf der TLC-Platte in einem Iso-Hemmdiagramm aufgetragen. Dabei konnte festgestellt werden, dass der Leuchtbakterientest auf der TLC-Platte für Bromoxynil um einen Faktor von ca. 1440 empfindlicher als der klassische Test in der Küvette ist.

Anwendungen

Überwachung von Deponiesickerwässern
Einen potenziellen Eintragspfad von anthropogenen Stoffen in das Grund- und Oberflächenwasser stellen Sickerwässer von Deponien dar. Dadurch können auch Trinkwasserressourcen beeinflusst werden. Je nach Art der Deponie kann die Substanzpalette aus einer Vielzahl unterschiedlichster Verbindungen und Umwandlungsprodukten bestehen.

Im vorliegenden Fall wurden in einer Deponiesickerprobe alle extrahierten UV/VIS-aktiven Substanzen mittels eines Mehrwellenlängenscans nach der HPTLC/AMD-Entwicklung erfasst (Abb. 3). Durch eine Aufnahme der Biolumineszenz auf der mit einer Vibrio fischeri-Suspension benetzten HPTLC-Platte mit Hilfe einer CCD-Kamera konnten zudem noch bioaktive Substanzen aus den Proben detektiert werden. Aus den Daten der digitalen Aufnahme ließen sich die Hemmwerte ortsaufgelöst als Γ-Wert-Chromatogramm berechnen und darstellen. Je größer der Gamma-Wert ist, desto stärker ist die Hemmung der Biolumineszenz der Leuchtbakterien einzustufen. Diese Methodenkombination zur Erfassung von Expositon und Wirkung ist exemplarisch in Abbildung 3 dargestellt. Hier zeigt sich, dass die UV-Absorption erwartungsgemäß nicht immer mit der Leuchtbakterien-Hemmung korreliert. Zusätzlich zum Leuchtbakterientest wurde auf einer parallel entwickelten HPTLC-Platte der Acetylcholinesterase-Hemmtest (AChE-Hemmtest) durchgeführt [7]. Dabei erscheinen potenziell neurotoxische Substanzen als helle Banden auf einem rötlichen Untergrund. Die Stärke dieser Hemmung korrelierte in dem dargestellten Beispiel wiederum nicht mit der Biolumineszenz-Hemmung von Vibrio fischeri. Auch zeigten die die AChE-Hemmung bewirkenden Substanzen keine starke UV-Absorption.

Untersuchung von Kunstrasen-Eluaten

Die Qualität des Grundwassers kann auf unterschiedlichste Weise beeinflusst werden. So können selbst aus Kunstrasen-Sportplatzbelägen umweltrelevante Substanzen durch den Regen ausgewaschen werden und bei einer fehlenden Drainage in das Grundwasser gelangen. Kunstrasenflächen finden zunehmend für Fußball und andere Sportarten Verwendung. Die Elastikschicht des Kunstrasens besteht meist aus polyurethan-gebundenen Gummigranulaten. Für diese Schicht werden außer neuen synthetischen Gummigranulaten (Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk, EPDM) auch Gummirecyclate, die beispielsweise von Altreifen stammen, eingesetzt. Neben der Erfüllung der Sportfunktion für die einzelnen Sportarten und der Schutzfunktion des Sportlers muss der Belag bestimmte Umweltanforderungen erfüllen [14].

Zur Simulation der Auswaschung durch Regen wurde eine Probe der Elastikschicht des frisch verlegten Kunstrasens 24 h mit Laborreinstwasser eluiert. Anschließend erfolgte eine Extraktion des wässrigen Eluates mit tertiär-Butyl-methylether (TBME) und die Auftragung eines aliquoten Extraktanteils auf eine HPTLC-Platte. Nach der HPTLC/AMD-Entwicklung und Tauchung der Platte in eine Leuchtbakterien-Suspension erfolgte die Aufnahme der Leuchtaktivität der Bakterien mittels einer CCD-Kamera, wobei sich eine Vielzahl von Hemmbanden zeigte (Abb. 4 A)
Um auch massenspektrometrische Informationen zur Identifizierung der einzelnen Hemmsubstanzen zu erhalten, erfolgte eine Entwicklung auf einer zweiten Platte unter den gleichen Trennbedingungen. Von dieser wurden die einzelnen Substanzbanden mittels eines TLC-MS-Interface zunächst in ein Vial extrahiert und anschließend mit einem HPLC-QTOF-System weiter untersucht. Nach der Aufnahme der UV/VIS-Remissionsspektren direkt auf der Platte wurde eine UV/VIS-Spektrenbibliotheksabfrage (ca. 300 Substanzen) durchgeführt. Weiterhin konnten mit Hilfe der HPLC-QTOF-Analyse aus den exakten Massen und den Isotopenmustern Summenformeln generiert werden. Durch die Kombination der Ergebnisse, die mit diesen beiden Methoden erhalten werden können, ist es möglich, neue Umweltkontaminanten nachzuweisen. So wurde beispielsweise im beschriebenen Fall die Substanz 2-Hydroxybenzothiazol identifiziert (Bande 9, markiert in Abb. 4; siehe auch Abb. 5)

Kontrolle der Abwasserreinigung

Iodierte Röntgenkontrastmittel (RKM) werden in der medizinischen Diagnostik zur Darstellung von Blutgefäßen oder Hohlräumen eingesetzt. Nach der Anwendung und Ausscheidung gelangen sie weitgehend unverändert über das Abwasser und die Kläranlagen in die als Vorfluter genutzten Oberflächengewässer. Aufgrund ihrer großen Einsatzmenge und ihrer Persistenz sind RKM verhältnismäßig häufig in der aquatischen Umwelt zu finden. Es gibt verschiedenste Strategien zur Verminderung des Eintrags von RKM in die Umwelt. Unter anderem wurde die Bestrahlung von Abwasserteilströmen mit UV-Licht erprobt. Jedoch ist bisher die Bildung von Oxidationsnebenprodukten bei der UV-Lichtbehandlung und deren biologische Wirkung weitgehend unbekannt. Am Beispiel eines Prozesswassers wurde dies mit Hilfe des Leuchtbakterientests auf der TLC-Platte untersucht. Das Bild der entwickelten und getauchten Platte zeigt Abb. 6, wobei für die Referenzstandards (Bahnen 8 und 9) keine Wirkung auf die Biolumineszenz von Vibrio fischeri zu beobachten war. Jedoch hatten einige während der UV-Lichtbestrahlung entstehende und bis jetzt unbekannte Nebenprodukte einen erheblichen Einfluss auf den Stoffwechsel und somit auf das Leuchten der Bakterien. So konnte eine Verstärkung aber auch eine Hemmung der Biolumineszenz beobachtet werden. Ein Anstieg der Hemmung trat bei den Substanzen mit den Rf-Werten von ca. 0,7 und ca. 1 auf. Die Toxizität auf Vibrio fischeri von der Substanz bei Rf = 0,7 nahm mit zunehmender Bestrahlungszeit zu, während gleichzeitig die RKM Iopamidol und Iopromid abgebaut wurden.

Zusammenfassung und Ausblick

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die bisher in der organischen Spurenanalytik wenig beachtete HPTLC/AMD-UV/VIS in Kombination mit der Biolumineszenz-Detektion in den verschiedensten Umweltbereichen zur Ermittlung des Vorkommens und der Wirkung von organischen Substanzen erfolgreich eingesetzt werden kann. Dies ist in der Tatsache begründet, dass es sich bei der TLC um ein offenes Trennsystem handelt, wodurch sich vielfältige Detektionsmöglichkeiten eröffnen, die bei geschlossenen Trennsystemen nur schwer mit ausreichender Empfindlichkeit realisierbar sind. Nach der Trennung der organischen Spurenstoffe auf der TLC-Platte ist die Anwendung weiterer Wirktests, wie beispielsweise des Acetylcholinesterase-Hemmtests, möglich.

In der kombinierten Anwendung mit der QTOF-Massenspektrometrie kann es weiterhin gelingen, gezielt unbekannte bioaktive Substanzen zu identifizieren. Der Analytiker hat somit ein empfindliches Werkzeug zur Ermittlung von Exposition und Wirkung als Ergänzung zu den etablierten Analysenmethoden zur Verfügung.

Literatur
[1] Farré Ml. et al.: Fate and toxicity of emerging pollutants, their metabolites and transformation products in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 27(11):991-1007 (2008)
[2] Seitz W. et al.: Monitoring of iodinated X-ray contrast media in surface water. Chemosphere 64(8):1318-1324 (2006)
[3] Weber WH. et al.: 1H-Benzotriazol und Tolyltriazole in der aquatischen Umwelt Vorkommen in Grund-, Oberflächen- und Abwasser im Gebiet Donauried-Hürbe. Vom Wasser 107(4):16-24 (2009)
[4] Burger K.: DC-PMD, Dünnschicht-Chromatographie mit Gradienten-Elution im Vergleich zur Säulenflüssigkeits-Chromatographie. Fresenius‘ Journal of Analytical Chemistry, 318(3):228-233 (1984)
[5] De La Vigne U. et al.: Application of high-performance thin-layer chromatography and automated multiple development for the identification and determination of pesticides in water. Journal of Chromatography A, 553:489-496 (1991)
[6] Eberz G. et al.: Bioactivity screening by chromatography-bioluminescence coupling. Chromatographia 43(1):5-9 (1996)
[7] Weins C. und Jork H.: Toxicological evaluation of harmful substances by in situ enzymatic and biological detection in high-performance thin-layer chromatography. Journal of Chromatography A 750(1-2):403-407 (1996)
[8] Weber WH. et al.: Luminographic detection of toxicity with Vibrio fischeri. CBS - Camag Bibliography Service 94:2-4 (2005)
[9] Schulz W. et al.: Use of Vibrio fischeri for screening for bioactivity in water analysis. JPC - Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 21(6):427-430 (2008)
[10] Klöppel A. et al.: HPTLC coupled with bioluminescence and mass spectrometry for bioactivity-based analysis of secondary metabolites in marine sponges. JPC - Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 21(6):431-436 (2008)
[11] Müller A, Weiss SC, Schulz W, Seitz W, Albert R, Ruck WKL, Weber W.H: Combination of different liquid chromatography/mass spectrometry technologies for the identification of transformation products of rhodamine B in groundwater. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2010, 24(5):659-666.
[12] Weber WH, Seitz W, Schulz W, Wagener H-A: Nachweis der Metaboliten Desphenyl-chloridazon und Methyl-desphenyl-chloridazon in Oberflächen-, Grund- und Trinkwasser. Vom Wasser 2007, 105(1):3-34.
[13] DIN EN ISO 11348-1. 2009.
[14] DIN V 18035-7 2002.

 

GIT Webtipp:
HPTLC Symposium 2011, 6.-8. Juli in Basel

 


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