20.05.2013
ForschungUmwelt

LC-MS in der Spurenstoffanalytik

Aktuelle Trends zur Quantifizierung und Identifizierung persistenter Substanzen im Abwasser

  • Abb. 1: Großtechnische Ozonung des Ablaufs der Kläranlage Duisburg-Vierlinden (Wirtschaftsbetriebe Duisburg AöR) mit der Möglichkeit zum getrennten Ozoneintrag über Diffusoren oder Injektor mit nachgeschaltetem Festbettverfahren (Bild: Grontmij GmbH).Abb. 1: Großtechnische Ozonung des Ablaufs der Kläranlage Duisburg-Vierlinden (Wirtschaftsbetriebe Duisburg AöR) mit der Möglichkeit zum getrennten Ozoneintrag über Diffusoren oder Injektor mit nachgeschaltetem Festbettverfahren (Bild: Grontmij GmbH).
  • Abb. 1: Großtechnische Ozonung des Ablaufs der Kläranlage Duisburg-Vierlinden (Wirtschaftsbetriebe Duisburg AöR) mit der Möglichkeit zum getrennten Ozoneintrag über Diffusoren oder Injektor mit nachgeschaltetem Festbettverfahren (Bild: Grontmij GmbH).
  • Abb. 2: MRM-Chromatogramm für 50 abwasserrelevante Substanzen. (LC: Spark Holland Symbiosis Pico, freundliche Leihgabe der Axel Semrau GmbH,MS: AB Sciex QTrap 3200, Säule: Phenomenex Kinetex 1,7 μm C18 100 Å 50 x 2,1 mm, Flussrate: 0,4 ml/min).
  • Abb. 3: Darstellung der im positiven (n = 186) und negativen (n = 293) Ionisationsmodus ermittelten möglichen Transformationsprodukte der Ozonung des Ablaufs der Kläranlage Bad Sassendorf (Versuchseinstellung, 2 mg/l Ozon, volumengesteuert) [2].
  • Dr. rer. nat. Christoph Portner, Wissenschaftlicher Mitarbeiter, Bereich Umwelthygiene & Spurenstoffe
  • Dr. rer. nat. Jochen Türk, Bereichsleiter Umwelthygiene & Spurenstoffe, Institut für Energie und Umwelttechnik e.V. (IUTA), Duisburg

Eintrag, Vorkommen und die damit verbundenen schädlichen Effekte von Arzneimitteln und Industriechemikalien in der aquatischen Umwelt stehen im Fokus vielfältiger Forschungsaktivitäten wie z. B. Riskwa (BMBF, Deutschland), Strategie Micropoll (BAFU, Schweiz) und F&E-Vorhaben des MKULNV in Nordrhein-Westfalen. Nachdem zuvor bereits vorgeschlagene Grenzwerte für Arzneimittelwirkstoffe in der letzten Revision der neuen Oberflächengewässerverordnung 2011 mit Verweis auf die europäische Wasserrahmenrichtline (WRRL) zurückgezogen wurden, hat die Europäische Kommission am 31. Januar 2012 nun Umweltqualtitätsnormen (UQN) für mehrere Hormone sowie Carbamazepin und Diclofenac vorgeschlagen.

Die Mikroverunreinigungen gelangen vor allem durch die unvollständige Elimination bei der biologischen Abwasserreinigung mit dem Kläranlagenablauf in die Oberflächengewässer. Zur Reduktion dieser prioritären Stoffe in den Kläranlagenabläufen wird als vierte Reinigungsstufe derzeit die Ozonung und die Zugabe von Pulveraktivkohle im großtechnischen Maßstab erprobt und auf ihre Praxistauglichkeit geprüft (Abb. 1) [1 - 3]. Neben dem Monitoring der Schadstoffkonzentrationen ist auch zur Aufklärung der Reaktionswege die Identifizierung von Transformationsprodukten und Metaboliten erforderlich. Die Auswirkungen des Eintrages dieser Substanzen auf das Ökosystem und die menschliche Gesundheit muss auf Basis von wirkungsbezogenen Testverfahren anhand ihrer toxikologischen Eigenschaften erfolgen [1 - 2].
Vor diesem Hintergrund sind für die Überwachung von Einträgen und Grenzwerten der Mikroverunreinigungen empfindliche LC-MS Target-Analysemethoden notwendig, die nach Möglichkeit eine große Anzahl und ein breites Polaritätsspektrum von Analyten erfassen können (Abb. 2). Andererseits sind für die umfassende Charakterisierung und Identifizierung von Analyten ohne direkten Bezug auf Referenzstandards, wie sie mit hochauflösenden Massenspektrometern möglich sind, Strategien zur rationalen Auswertung von Non-Target-Analysen erforderlich.

Bei der Target-Analytik ist eine stetige Steigerung der Sensitivität durch neue Geräteentwicklungen zu beobachten. Neben den Tandemmassenspektrometern sind mit modernen hochauflösenden Massenspektrometern mittlerweile auch anspruchsvolle Quantifizierungen möglich.

Diese Geräte haben meist eine sehr hohe Datenaufnahmerate von bis zu 200 Hz, mit der sich auch bei Peakweiten von 1 - 2 Sekunden noch genügend Datenpunkte akquirieren lassen, wobei immer das vollständige Massenspektrum aufgenommen wird. Durch die Verwendung von retentionszeitabhängigen MS/MS Experimenten lassen sich mit Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern auch mehrere 100 Massenübergänge in eine Multimethode integrieren. Die Umschaltzeiten zwischen den Polaritäten liegen bei Tandemmassenspektrometern im unteren Millisekunden-Bereich, womit sich bei Target-Screenings separate LC-Läufe einsparen lassen.

Methodenentwicklung zur Quantifizierung
Dieser Trend zu immer umfassenderen Multimethoden erfordert auch neue Konzepte zur Datenauswertung. Herstellerseitige Softwareentwicklungen und neue Arbeitsabläufe (Workflows) sollen den Anwender u. a. bei der Sichtung von hunderten Massenspektren oder der automatischen Auswertung bei der Standardaddition unterstützen. Bei allen technischen Neuerungen kann die Methodenentwicklung zur Quantifizierung von Spurenstoffen schnell reichlich Arbeit nach sich ziehen. Zu wenig Retention, schlechte Ionisierbarkeit oder chromatografische Trennleistung sind die wesentlichen Herausforderungen. Hinzu kommen störende Matrixeffekte und damit verbunden die Frage nach der richtigen Kalibrationsmethodik. Die Verwendung von Isotopen-markierten Referenzstandards für jeden Analyten wäre ideal, ist aufgrund der hohen Kosten und der teilweise eingeschränkten Verfügbarkeit allerdings nicht immer möglich. Bei der Standardaddition müssen die Proben mit jedem Analyten in der zum Ausgangswert passenden Konzentration dotiert werden. Das erfordert nicht nur eine separate Messung vorab, sondern erhöht auch den Aufwand im Labor. Zusätzlich erschweren die teilweise über mehrere Zehnerpotenzen schwankenden Spurenstoffkonzentrationen zwischen einzelnen Abwasserproben die Messungen durch Verschleppungen und die Auswahl des Kalibrationsbereiches.

Aktuelle Forschungsaktivitäten in der Wissenschaft und von Seiten der Hersteller zur Non-Target-Analytik mit hochauflösenden Massenanalysatoren (HRMS) beschäftigen sich mit der Auswertung und Interpretation der umfangreichen Messdaten sowie der Entwicklung von automatischen Arbeitsabläufen. Grundsätzlich ist hier zwischen der Identifizierung anhand der ermittelten Summenformel von erwarteten Analyten (Suspected-Screening) und dem Non-Target-Screening ohne jede a priori Information zu differenzieren [4 - 5]. Neben der elementaren Zusammensetzung des Vorläuferions können einige HRMS-Geräte (Q-TOF, Orbitrap etc.) auch die exakte Masse der Produkt-Ionen bestimmen. Die weitere Eingrenzung der möglichen Summenformeln wird anhand der Isotopenverteilung vorgenommen.

Für die Suche nach bekannten Analyten aus den Bereichen Pharmazeutika oder Kontaminanten aus der Rückstandsanalytik können eigene oder öffentliche MS-Datenbanken wie z. B. Daios, Massbank oder Norman genutzt werden [5]. Kommerzielle Referenzspektrendatenbanken der Gerätehersteller, der NIST oder die Wiley Registry (9. Edition) beinhalten mittlerweile auch eine große Anzahl von LC-MS / MS Spektren. Spektrenvergleiche zeigen auch bei der Verwendung sehr unterschiedlicher MS-Geräte gute Übereinstimmungen [6].

Die Non-Target Analytik gleicht der Suche nach der Nadel im Heuhaufen (Abb. 3). Ohne weitere Kenntnisse zu den möglichen Substanzen in der Probe ist eine eindeutige Identifizierung nur sehr schwer möglich. Dennoch bietet sie die Möglichkeit z. B. Tagesgänge zu vergleichen und Unterschiede oder Zusammenhänge zwischen den Probenahmeorten und -tagen mittels multivariater Datenanalyse zu untersuchen [7]. Die Summenformeln der relevanten Massen und ihr Fragmentierungsmuster können u. a. mit der frei zugänglichen Software MetFrag durch in silico Fragmentierung die Anzahl der möglichen Strukturformeln eingrenzen [8]. Die Retentionszeit als ein weiteres Kriterium kann zur Absicherung des Ergebnisses nur bei Verfügbarkeit der Referenzsubstanz genutzt werden. Auch ohne Referenzsubstanz kann anhand des Hydrophobizitätsindexes die Plausibilität der Retentionszeit der identifizierten Strukturformel erfolgen [9].

Chromatographische Trennung
Neben den Strategien und Arbeitsabläufen zur Datenauswertung zeigt sich ein Trend zur Steigerung der Empfindlichkeit nicht nur durch neue Massenanalysatoren und neue Ionenquellen, sondern auch bei der chromatographischen Trennung. Neben den „sub 2 µm" Partikel erlauben „Fused core" oder monolithische Trennsäulen immer höhere lineare Fließgeschwindigkeiten bei hoher Peakkapazität und Trennleistung. In der Wasseranalytik wird immer häufiger auch auf die Probenvorbereitung im Labor verzichtet und die Probe direkt injiziert. Probleme ergeben sich bei der Large-Volume-Injektion für sehr polare Analyten, die sich nicht am Säulenkopf fokussieren lassen. Seriell gekoppelte Trennsäulen mit unterschiedlichen Eigenschaften oder Online-SPE-HPLC Systeme bieten hier Möglichkeiten zur Methodenentwicklung.
Bei allen neuen Entwicklungen sind die Kosten und der zeitliche Aufwand für die steigende Automatisierung bei der Probenvorbereitung, Messung und Auswertung stets zu berücksichtigen. Umfassende LC-MS Methoden ermöglichen zwar ein schnelles Target-, Suspected- bzw. Non-Target-Screening, stellen aber immer nur einen Kompromiss hinsichtlich der Sensitivität dar. Die Versuchsplanung, Dateninterpretation und Bewertung der Messergebnisse bleibt weiterhin beim Anwender.

Literatur
[1] J. Türk et al.: BMWi, AiF „Otto von Guericke" e. V. (IGF-FV 15862 N), (2011)
[2] Grünebaum T. et al.: Teilprojekt: 6 und T. C. Schmidt et al.: Teilprojekt: 10, Abschlussberichte Phase 1, MKULNV NRW (AZ IV-7-042 600 001F und AZ IV-7-042 600 001J, Vergabe-Nr. 08/058.1), (2011). http://www.lanuv.nrw.de/wasser/abwasser/forschung/abwasser.htm
[3] Abegglen C. und Siegrist: H. Mikroverunreinigungen aus kommunalem Abwasser. Verfahren zur weitergehenden Elimination auf Kläranlagen. Bundesamt für Umwelt, Bern, Umwelt-Wissen Nr. 1214, (2012)
[4] M. Krauss et al.: Analytical and Bioanalytical Chemistry 397, 943-951 (2010)
[5] M. Zedda und C. Zwiener: Analytical and Bioanalytical Chemistry 403, 2493-2502 (2012)
[6] H. Oberacher et al.: Journal of Mass Spectrometry 47, 263-270 (2012)
[7] Muller A. et al.: Chemosphere 85, 1211-1219 (2011)
[8] S. Wolf et al.: BMC Bioinformatics, 11, 148, 1-12 (2010)
[9] Ulrich N. et al.: Journal of Chromatography A, 1218, 8192-8196 (2011)

Autor(en)

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47229 Duisburg
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