23.06.2016
ForschungUmwelt

Nanomaterialien in Umweltproben

Sensitive Methode zum Nachweis im ppb-Bereich

  • Abb. 1: Ausschnitt einer transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme einer menschlichen Fettzelle. Oben: unbehandelte Zelle (= ohne Nanopartikel). Unten: Zelle nach Behandlung mit Gold-Nanopartikeln. Die Partikel reichern sich in den Fetttropfen der Zelle an.Abb. 1: Ausschnitt einer transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme einer menschlichen Fettzelle. Oben: unbehandelte Zelle (= ohne Nanopartikel). Unten: Zelle nach Behandlung mit Gold-Nanopartikeln. Die Partikel reichern sich in den Fetttropfen der Zelle an.
  • Abb. 1: Ausschnitt einer transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme einer menschlichen Fettzelle. Oben: unbehandelte Zelle (= ohne Nanopartikel). Unten: Zelle nach Behandlung mit Gold-Nanopartikeln. Die Partikel reichern sich in den Fetttropfen der Zelle an.
  • Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme epithelialer Zellen nach Exposition mit Eisen-Nanopartikeln. Grün: Zellmembran.  Rot: In der Zelle angereicherte Eisen-Nanopartikel.

Sowohl in Textilien, Kosmetika und Lebensmitteln, als auch in Nahrungsergänzungsmitteln, Waschmitteln oder als Beschichtung von Küchengeräten sind Nanomaterialien (NM) verarbeitet. Die zahlreichen Einsatzmöglichkeiten und die stetig steigenden Produktionsmengen der NM verdeutlichen die steigende Exposition von Mensch und Umwelt mit synthetischen NM.

Aufgrund fehlender Messtechniken zur Bestimmung von Dauer und Höhe der Exposition des Menschen gegenüber NM, fehlen derzeit konkrete Daten zur Beurteilung der NM-Exposition und des Gefährdungspotenzials.

Methoden
Die Kenntnis der tatsächlich in der Umwelt auftretenden NM-Konzentration ist essentiell, das dadurch bedingte Gefährdungsmaß für Umweltorganismen zu bewerten. Bisher gibt es jedoch keine Studien, die die reale NM-Konzentration in unterschiedlichen Umweltkompartimenten entlang der Nahrungskette bestimmt haben. Der Eintrag und die Verteilung der NM in der Umwelt wurden bisher nur mit Hilfe von Computermodellen simuliert. Die genauen Konzentrationen synthetischer NM in der Umwelt, deren Funktionalität und Akkumulationsverhalten sowie deren Auswirkungen auf das Ökosysteme sind bisher nicht ausreichend geklärt.

Im Rahmen des Projekts „Nanoumwelt“ wurde eine sensitive Methode entwickelt, die NM in unterschiedlichen Umweltproben wie Flusswasser, Tiergewebe oder humanem Urin und humanem Blut in einem Konzentrationsbereich von Nanogramm pro Liter (ppb – parts per billion) nachweist. Mit der neuen Methode lassen sich nicht nur wie bisher viele NM in klaren Flüssigkeiten, sondern auch sehr wenige Partikel in komplexen Stoffgemischen, wie menschlichem Blut oder Bodenproben detektieren und charakterisieren. Der Ansatz basiert auf der Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF), mit deren Hilfe es möglich ist, komplexe, heterogene Stoffgemische aus Flüssigkeiten und Partikeln in ihre Einzelteile aufzutrennen und dabei die festen Bestandteile nach ihrer Größe zu sortieren. Das gelingt durch das Zusammenwirken eines kontrollierten Flüssigkeitsstroms und eines physikalischen Trennfeldes, welches senkrecht auf die fließende Suspension wirkt. Im ersten Schritt trennt das Projektteam die NM mittels asymmetrischer Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4) (AF2000 Multiflow FFF, Postnova Analytics) nach Material und/oder Größe.

Im zweiten Schritt folgt die Analyse der Partikelfraktionen mit unterschiedlichen Detektoren, wie z. B. dem MALS-, UV- oder DLS-Detektor. Des Weiteren werden die Oberflächenladung (Zetasizer Nano, Malvern) und das Material mittels ICP-MS bestimmt.

Probenvorbereitung
Damit der Nachweis gelingt, müssen die Umweltproben entsprechend vorbereitet sein. Die zu untersuchenden Umwelt- und Humanproben, wie Flusswasser, menschlichen Urin, Humanblut oder Fischgewebe für die AF4-Analyse wurden mit speziellen Enzymen aufgearbeitet. Bei der Prozessentwicklung wurde darauf geachtet, dass die NM während des Aufschlussverfahrens nicht zerstört oder modifiziert werden, um den Nachweis der realen Eigenschaften der NM in den Umwelt- und Humanproben zu gewährleisten.

Nahrungskette
Ziel ist die erstmalige Bestimmung der realen NM-Konzentration in unterschiedlichen Umweltkompartimenten entlang der Nahrungskette. Hierbei soll unter anderem der essentiellen Frage nachgegangen werden, wie weit ein Transfer von NM über die Nahrungskette stattfindet. In einer „kleinen“ Nahrungskette, bestehend aus Wasserflöhen und Zebrabärblingen, wurde bereits gezeigt, dass eine Übertragung der NM auf Zebrabärblinge, welche mit TiO2-exponierten Daphnien gefüttert wurden, stattfindet. Ebenfalls werden Zusammenhänge zwischen einer hohen NM-Belastung und der erhöhten Anreicherung von Schwermetallen, wie z. B. Cadmium oder Arsen, in Gewässern belegt. Die physikochemischen Eigenschaften der NM während des NM-Lebenszyklus wurden bisher nur unzureichend untersucht. Deshalb wurde, neben Gewässerproben, auch in Proben von Primär- und Sekundärkonsumenten mit Schlüsselfunktionen in der Nahrungskette, die reale Konzentration und Charakteristika der NM bestimmt.

Umweltproben
Seit Januar 2012 betreibt das Fraunhofer IBMT im Auftrag des Umweltbundesamts (UBA) die „Umweltprobenbank des Bundes (UPB) – Humanproben“. Jährlich sammelt die Arbeitsgruppe Biomonitoring & Biobanken an vier Orten Deutschlands Blut- und Urinproben von jeweils 120 Freiwilligen. Die Einzelproben sind ein wertvolles Instrument, um zeitliche Trends der menschlichen Schadstoffbelastung nachzuverfolgen. Für das Projekt wurden zusätzlich Blut und Urin gespendet, am Fraunhofer IBMT kältegelagert und dafür genutzt, die neue Nachweismethode zu erarbeiten. Nach Genehmigung durch das UBA könnten zum Teil auch die Humanproben des UPB-Archivs mit der neuen Methode untersucht werden.

Effekte
Neben der Analytik der NM in Umwelt- und Humanproben werden Effekte von NM im Niedrigdosisbereich untersucht. Auf zellulärer Ebene kann die Exposition von NM verschiedene Effekte auslösen. Neben Entzündungsmechanismen können Proliferations-, Motilitäts- und Adhäsionsveränderungen induzieren und zu Apoptose, Nekrose oder Autophagozytose führen. Im Zellkern können NM DNA-Schäden oder chromosomale Aberrationen verursachen. Die Barrieregängigkeit stellt einen weiteren Parameter zur Evaluierung des Gefährdungspotenzials von NM für Mensch und Umwelt dar. Die Fraunhofer-Forscher legen. Hierbei liegt der Fokus auf der Untersuchung des Transports von NM über menschliche Barrieren, wie die Lunge oder den Gastrointestinaltrakt. Hierbei wird zwischen Luft-Flüssigkeits-Grenzschichten (z. B. Lungenbarriere) und Flüssigkeit-Flüssigkeits-Grenzschichten (z. B. intestinale Barriere) unterschieden. Um die Interaktions- und Transportmechanismen von NM an biologischen Barrieren und deren Mukusschicht zu untersuchen und zu bewerten, wurden in-vitro- und ex-vivo-Modellsysteme verwendet um die Exposition der Schutzbarrieren des Organismus mit umweltrelevanten Konzentrationen zu simulieren und dadurch induzierte zelluläre Effekte zu quantifizieren. Im Fokus stehen hierbei umweltrelevante, niedrig dosierte Expositionen und Langzeituntersuchungen.

Neben der Haut und dem Gastrointestinaltrakt gilt die Lunge, mit einer Depositionsrate von 70%, als das für die Aufnahme von NM kritischste Organ. Die inhalative Exposition ist somit für ein mögliches Risiko des Menschen von vorrangiger Bedeutung. Die Wechselwirkungen von NM mit der Lungenbarriere und der gastrointestinalen Barriere werden untersucht. Um zu verstehen, wie NM über die genannten Barrieren transportiert werden wurden eigens zellbasierte 2D- und 3D-Kokultur-Modelle entwickelt, aber auch Primärgewebe des Schweins werden verwendet. Ein Ziel ist es, die Zellmodelle mit nicht-invasiven Analysemethoden zu kombinieren, um Echtzeit-Multiparameteranalysen zu realisieren. Um die Überwindung von NM über die Lungenbarriere zu untersuchen, wird eine Ko-Kultur aus Lungen- und Immunzellen auf einer porösen Polystyrol-Membran kultiviert (Transwell-Technologie, Corning). Die Zellen werden von der Unterseite mit Nährstoffen versorgt und von der Oberseite mit einer künstlichen NM-haltigen Nebelwolke behandelt, um so die Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht „Lunge“ zu simulieren. Mit diesem Modell werden nanotoxikologische Studien im Niedrigdosisbereich durchgeführt, um das von NM ausgehende potenzielle Risiko für Mensch, Tier und Umwelt besser abschätzen zu können. Hierbei wurde ein vom Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME aus pluripotenten Stammzellen entwickeltes Modell zur Untersuchung der Kardiotoxizität verwendet. Der Schweizer Projektpartner Empa realisierte ein Plazenta-Barriere-Modell zur Studie des NM-Transports zwischen Mutter und Kind.

Projekt
Das Forschungsprojekt „Nanoumwelt“ startete im Oktober 2014 und dauert 36 Monate. Ziel ist es, Methoden zu entwickeln, die kleinste Mengen von NM in Umweltproben nachweisen. Mit diesen Informationen wollen die Partner die Wirkung der NM auf Mensch, Tier und Umwelt abschätzen. Der Fokus liegt auf kommerziell bedeutsamen, schwer abbaubaren, metallischen (Silber, Titandioxid), kohlenstoffhaltigen (Kohlenstoff-Nanoröhrchen) und kunststoffbasierten (Polystyrol) NM. Das Projekt liefert einen Beitrag zu Risikoabschätzung, -vorhersage und –bewertung einer möglichen Human- und Ökotoxizität von NM.

Danksagung
Das Projekt wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert. Unter der Leitung von Postnova Analytics haben sich zehn Partner zusammengefunden: Fraunhofer-Institute für Biomedizinische Technik IBMT und für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME, Umweltbundesamt, Empa (Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt), PlasmaChem, Senova, Forschungszentrum für Medizintechnik und Biotechnologie fzmb, Universitäten Trier und Frankfurt, Rheingütestation Worms. 

Kontakt
Yvonne Kohl
Fraunhofer Institut Biomedical Engineering
Sulzbach

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/
Mehr Informationen: http://www.nanopartikel.info/projekte/laufende-projekte/nanoumwelt

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