Biosensoren für quantitive Analytik: Lebensmittel- und Wasseranalytik, Milchwirtschaft, Medizin

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests (a) des verwendeten Messaufbaus (b) und einer Kalibrierkurve (c)Abb. 1: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests (a) des verwendeten Messaufbaus (b) und einer Kalibrierkurve (c)
  • Abb. 1: Schematische Darstellung des Bindungshemmtests (a) des verwendeten Messaufbaus (b) und einer Kalibrierkurve (c)
  • Abb. 2: Logistik-Funktion

Biosensoren für quantitive Analytik: Lebensmittel- und Wasseranalytik, Milchwirtschaft, Medizin. Eine Beschreibung der Einsatzmöglichkeiten von vollautomatischen Biosensorsystemen für die quantitative Analytik. Beispiele für Anwendungen in der Wasser- und Milchanalytik, sowie des Point-of-Care-Testing (POCT) werden vorgestellt.

In vielen Bereichen der Kontrollanalytik ist eine kontinuierliche Überwachung zunehmend erforderlich und erwünscht. Klassische Methoden wie GC und HPLC ermöglichen zwar einen sehr sensitiven Nachweis von Analyten, sind aber für hohe Durchsatzraten aus Zeit-und Kostengründen weniger geeignet. Genau diese Anforderungen einer schnellen, kostengünstigen und sensitiven Detektion erfüllen jedoch Biosensoren.

Ziel bei der Entwicklung unserer Biosensoren ist ein automatisierter Einsatz für quantitative Messungen in verschiedenen Matrices. Der modulare Aufbau der verwendeten Oberflächenchemie erlaubt eine flexible Anpassung an die äußeren Verhältnisse, wodurch in erster Linie eine hohe Stabilität der sensitiven, biologischen Schicht erreicht werden soll [1, 2]. Eine technische Anwendung von automatisierten Sensorsystemen ist in vielen Bereichen denkbar. Das Potenzial dieser Technik soll hier anhand von drei Einsatzmöglichkeiten zur Messung in Wasser, Kuhmilch und menschlichem Serum aufgezeigt werden.

Beschreibung des Biosensors

Die verwendeten Sensorsysteme basieren auf der TIRF-Methode (Total Internal Reflection Fluorescence). Zusammen mit einer Fließinjektion wurde das Messprinzip im River Analyser (EUProjekt RIANA, Förderkennzeichen: ENV4-CT95- 0066) verwirklicht [3]. Dieser optische Biosensor arbeitet mit fluorophormarkierten Antikörpern als biologisches Erkennungselement für ausgewählte Analyte. Bei den als Bindungshemmtest durchgeführten Messungen wird die Probenlösung mit einer Standardantikörperlösung vorinkubiert. Danach wird die Reaktionslösung über den Transducer gepumpt und freie Bindungsstellen des Antikörpers können an die mit dem entsprechenden Analytderivat chemisch modifizierte Oberfläche des Glastransducers binden.

An Stellen der inneren Totalreflexion (Spots) eines Laserstrahls im wellenleitenden Transducer entsteht ein evaneszentes Feld. Der Fluorophor wird oberflächennah an diesem Spot zur Fluoreszenz angeregt. Der Transducer des RIANA bietet die Möglichkeit, an sechs voneinander räumlich getrennten Spots verschiedene Analyte parallel zu detektieren. Das Fluoreszenzlicht wird über Polymerfasern mit hoher numerischer Apertur und über Filter dem Detektionssystem, bestehend aus Photodioden und Lock-in Verstärker, zugeführt. Das zweite verwendete Gerät AWACSS (EU-Projekt: Automated Water Analyser Computer Supported System, Förderkennzeichen: EVK1-CT-2000-00045) beruht ebenfalls auf der Evaneszentfeldtechnik. Im Unterschied zum RIANA wird der Laserstrahl nicht frei in den Transducer eingekoppelt, sondern über eine in tegrierte Glasfaser (pig-tail). Der Vorteil dieses optisch integrierten Systems ist die größere Anzahl an Spots (bis zu 32) und daher die Möglichkeit, mehr Analyte parallel zu detektieren [4].

Versuchsbeschreibung

Bei einer Kalibrierung der Biosensoren werden neun Blindproben und neun Konzentrationsstufen, mit jeweils drei Replika, gemessen und für jede Stufe werden ein Mittelwert und eine Standardabweichung bestimmt. Der Mittelwert der Messwerte für die Blindproben wird auf 100 % gesetzt und die Mittelwerte der dotierten Proben werden auf diesen Wert bezogen. An die Mittelwerte und deren Standardabweichung wird anschließend eine Logistik- Funktion angepasst. Die Anpassung solcher sigmoidaler Funktionen ist im Bereich der Immunoassays weit verbreitet und die verwendete Logistik-Funktion mit ihren vier Parametern genießt große Anerkennung auf diesem Gebiet [5]. Logistik-Funktion siehe Abb. 2.

Der zulässige Arbeitsbereich für Immunoassays wird häufig über den 10 – 90 % Bereich des dynamischen Signals angegeben. Aus den Standardabweichungen der neunfach gemessenen Blindproben lassen sich mit Hilfe der zugehörigen Logistik- Funktion die Nachweisgrenzen (LOD) und die Bestimmungsgrenzen (LOQ) berechnen. Dazu wird, in Übereinstimmung mit IUPAC- Regeln, für die Nachweisgrenze die dreifache Standardabweichung der Blindwerte und für die Bestimmungsgrenze die zehnfache Standardabweichung der Blindwerte verwendet.

Einsatz in der Wasseranalytik

Im Zuge der Water Framework Directive (WFD) der Europäischen Union wird die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Überwachung von Gewässern immer deutlicher. Vor allem die lückenlose Überwachung von Flüssen stellt eine große Herausforderung dar. Selbst größere Schadstofffahnen können innerhalb von Minuten an der Überwachungsstelle vorüber fließen und bei einem Probennahme-Zyklus von 60 Minuten komplett unbemerkt bleiben. In diesem Fall bietet ein vollständig automatisiertes Sensorsystem die ideale Lösung. In dem EU-Projekt AWACSS wurde ein Biosensorsystem zur parallelen Detektion an bis zu 32 Spots unter Einsatz eines integriert optischen Transducers entwickelt. Eine Messung mit diesem System dauert maximal 12 Minuten, es ist keine Probenaufbereitung erforderlich und der Nachweis von Schadstoffen im unteren ng L–1-Bereich ist möglich. Das Gerät ist dazu in der Lage über mehrere Wochen selbstständig zu arbeiten [6].

Bestimmung von Progesteron in Kuhmilch

In der modernen Milchwirtschaft ist eine ertragreiche und effiziente Milchproduktion wichtig. Eine Kuh produziert jedoch nur nach der Geburt eines Kalbes Milch. Daher sorgt die industrielle Milchviehhaltung dafür, dass die Milchkühe regelmäßig trächtig werden, meist durch künstliche Besamung. Eine erfolgreiche Besamung hängt vom Zyklus der Kuh ab. Derzeit bestimmen Landwirte die Zeit des Eisprungs, indem sie das Verhalten der Kuh beobachten. Die Erfolgsquote liegt jedoch nur bei 35 –70 % und ist bei einer Haltung einer großen Anzahl von Tieren nicht durchführbar. Besser lässt sich der richtige Zeitpunkt für die Besamung über das Hormon Progesteron bestimmen. Dieses kann auch über Biosensoren ermittelt werden. Die eigentliche Herausforderung stellt hier die Matrix Milch dar. Kuhmilch besteht aus ca. 87 % Wasser, 4,9 % Laktose, 3,7 % Neutralfetten, 3,6 % Eiweiß, ca. 0,8 % Mineralstoffe und vielen Vitaminen. Durch die Vielzahl von Inhaltsstoffen werden hohe Anforderungen an den verwendeten Immunosensor gestellt, da die verschiedenen Bestandteile den Antikörper, die Sensoroberfläche und die Immunreaktion des Antikörpers mit dem Analyten beeinflussen können. Aufgrund des hohen Fettanteils müssen die Proben für die Messung im Verhältnis 1:10 mit Wasser verdünnt werden. Für die Messungen wurde der RIANA-Biosensor kombiniert mit einem HTC-PAL Autosampler verwendet. Damit ist es möglich, den Sensor zu kalibrieren und anschließend Realproben eines vollständigen Zyklus einer Kuh zu messen [7]. Der Arbeitsbereich des Immunoassays liegt zwischen 0,96 pgml–1 (LOD) und 3,5 ngml–1. Der Messvorgang des gesamten Assays kann auf bis zu 5 Minuten reduziert werden, so dass die Analyse während des Melkvorgangs vorgenommen werden kann. Eine Erweiterung des Sensors um weitere Analyten, z. B. Parameter für die Lebensmittelanalytik, ist denkbar.

Entwicklung für die Health-Care- Diagnostik/ Point-of-Care-Testing (POCT)

Da die Sensorsysteme sich schon als geeignet für Messungen von Realwasserproben und Kuhmilch erwiesen haben, liegt die Idee nahe, in weiteren Matrices zu messen. Messungen in menschlichem Serum stellen wegen des großen Anteils an Proteinen (Immunoglobulinen), einen hohen Anspruch an Biosensoroberflächen. Ein großer Einsatzbereich von Immunosensoren liegt bereits in der medizinischen Diagnostik. Das von der Europäischen Kommission seit November 2005 mit 11,5 Mio. € geförderte Projekt Care-Man (Förderzeichen: NMP4-CT-2006-017333), in dem sich 28 Partnerorganisationen (mit insgesamt 32 Arbeitsgruppen) aus 11 europäischen Ländern zusammengefunden haben und das von uns an der Universität Tübingen koordiniert wird, versucht, diesem Anspruch gerecht zu werden.

Care-Man steht für „Healthcare by Biosensor Measurements And Networking“und folgt dem Joint Call „Biosensors for Diagnosis and Healthcare“. Grundlage des Projekts ist eine modulare Plattform, die unterschiedliche Transduktionsprinzipien, biochemische Erkennungsmethoden und moderne Kommunikationsmittel kombiniert und mit der gleichzeitig mehrere charakteristische Parameter auch bei niedrigen Nachweisgrenzen erfasst werden können. Die im Projekt zu leistenden Arbeiten sind vielfältig. Neben der Synthese bzw. Modifikation von Erkennungsstrukturen werden verschiedene Multianalyt-Assayformate aufgebaut, Sensor-Chips und Techniken zur Signalverstärkung entwickelt und mit der Mikrofluidik und dem Probeneintrag abgestimmt. Als Rezeptoren werden Antikörper, Aptamere, DNA-Sequenzen oder synthetische Rezeptoren eingesetzt. Sämtliche Detektionsmodule beruhen auf einer optischen Nachweismethode. Außer der hier bereits vorgestellten Methode finden noch weitere Entwicklungen statt. Zwei Systeme verwenden planare Wellenleiter mit mehreren Spots. Im ersten Fall wird das Licht über ein Gitter eingekoppelt und die angeregte Fluoreszenz über eine CCD-Kamera ortsaufgelöst detektiert. Bei dem zweiten planaren Wellenleiter handelt es sich um ein integriert optisches System, bei dem das Licht über eine Faser eingekoppelt wird. Während das dritte System, das ebenfalls eine optische Anregung und Fluoreszenz-Detektion vorsieht, Kapillaren verwendet, in deren Inneren die Rezeptormoleküle angebunden sind, nutzt das vierte Detektionssystem die elektrochemische Anregung der Chemilumineszenz z. B. eines Ruthenium-Komplexes zum Nachweis der Wechselwirkungen.

Bei der Auswahl der medizinischen Parameter liegt der Hauptaugenmerk auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen auch im Zusammenhang mit Störungen z. B. des Schilddrüsenhormonspiegels; aber auch akute und chronische Entzündungen sowie bestimmte Krebserkrankungen sollen schneller, besser und günstiger nachgewiesen werden können.

Erste Messungen zeigen eine problemlose Bestimmung des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein (CRP) im erforderlichen Konzentrationsbereich. Andere Parameter können ebenfalls bereits nachgewiesen werden, aber noch nicht im Referenzbereich quantifiziert werden. Unter www.care-man.eu stehen weitere Informationen zur Verfügung.

Literatur

[1] Piehler, J.; Brecht, A.; Geckeler, K. E.; Gauglitz, G.: Surface modification for direct immunoprobes. Biosensors & Bioelectronics 11 (6 –7), 579 –590 (1996).

[2] Mutschler, T.; Kieser, B.; Frank, R.; Gauglitz, G.: Characterization of thin polymer and biopolymer layers by ellipsometry and evanescent field technology. Analytical & Bioanalytical Chemistry 374, 658 – 664 (2002).

[3] Klotz, A.; Brecht, A.; Barzen, C.; Gauglitz, G.; Harris, R. D.; Quigley, G. R.; Wilkinson, J. S.; Aduknesha, R.: Immunofluorescence sensor for water analysis. Sensor and Actuators, B: Chemical B 51 (1–3), 181–187 (1998).

[4] Tschmelak, J. et al.:Automated Water Analyser Computer Supported System (AWACSS) Part I:Project objectives, basic technology, immunoassay development, software design and networking. Biosensors & Bioelectronics 20, 1499 –1508 (2005).

[5] Dudley, R. A.; Edwards, P.; Ekins, R. P.; Finney, D. J.; McKemzie, I. G.; Raab, G. M.;Rodboard, D.; Rodgers, R. P.: Guidelines for immunoassay data processing. Clinical Chemistry 31 (8), 1264–1271 (1985).

[6] Proll, G.; Tschmelak, J.; Gauglitz, G.: Advanced Environmental Biochemical Sensor for Water Monitoring, Soil and Water Pollution Monitoring, Protection and Remediation. Springer Verlag, 2006, 131–145.

[7] Käppel, N. D.; Pröll, F., Gauglitz, G.: Development of a TIRF-based biosensor for sensitive detection of progesterone in bovine milk. Biosensors & Bioelectronics 22 (9 –10), 2295 –2300 (2007).

Kontakt

Dipl.-Chem. Christiane Albrecht

Prof. Dr. rer. nat. Günter Gauglitz

Eberhard-Karls-Universität Tübingen

Institut für Physikalische und Theoretische Chemie (IPTC)

Fax: 07071/29-5490

christiane.albrecht@ipc.uni-tuebingen.de

günter.gauglitz@ipc.uni-tuebingen.de

www.barolo.ipc.uni-tuebingen.de

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