Screeningmethoden für die Umwelt- und Bioanalytik

  • Dipl.-Chem. Heike Brandt, TU Bergakademie FreibergDipl.-Chem. Heike Brandt, TU Bergakademie Freiberg
  • Dipl.-Chem. Heike Brandt, TU Bergakademie Freiberg
  • Dr. Silke Tesch, TU Bergakademie Freiberg
  • Prof. Dr. Matthias Otto, TU Bergakademie Freiberg
  • Abb. 1: HPLC-ICP-OES-Kopplung
  • Abb. 2: Trennung von Antimon(III) als [SbCl4]- und Antimon(V) als [SbCl6]
  • Abb. 3: Trennung von Chrom(III) als EDTA-Komplex und Chrom(VI) als Chromat bei unterschiedlichen pH-Werten; a) pH = 4, b) pH = 7
  • Abb. 4: Trennung von Phenylarsenverbindungen bei pH 4 und einer Flussrate von 6,5 ml/min (pAAS p-Arsanilsäure, PAS Phenylarsonsäure, oAAS o-Arsanilsäure, Rox Roxarson, PAO Phenylarsinoxid)
  • Tab. 1: Untersuchte Metallspezies

Screeningmethoden für die Umwelt- und Bioanalytik. Screening auf Metalle und deren Spezies auf der Basis der HPLC-ICP-OES-Kopplung

Die Elementspeziesanalytik spielt heute im Bereich der Umwelt- und Bioanalytik eine wesentliche Rolle.

Besonders Schwermetalle und ­Metalloide in ihren Verbindungen werden mit den verschiedensten Kopplungstechniken analysiert, um die Toxizität, Mobilität, Verteilung und Verfügbarkeit der einzelnen Spezies zu charakterisieren.

Um in einer Probe die unbekannten Elemente zu identifizieren bietet sich unter anderem die Atomemissionsspektroskopie als Multielementmethode an. Aber um gleichzeitig die vorliegenden Spezies zu erfassen, muss zuvor eine Trennung dieser erfolgen.

Am häufigsten wird heute die HPLC-ICP-MS-Kopplung verwendet, deren Empfindlichkeit für bestimmte Anwendungen allerdings nicht notwendig ist. Da in unserem Labor die ICP-OES als Routinemethode bereits vorhanden ist, haben wir eine HPLC mit dem ICP-OES-Spektrometer gekoppelt.

Die eingesetzte Kopplung ist eine neue Gerätekombination der Firma ThermoFisher Scientific und wird unter Verwendung des Mira Mist Zerstäubers vorgestellt.

Ein Finnigan Surveyor Plus LC System mit Niederdruckgradientensystem für bis zu vier Eluenten sowie Vakuumentgaser, Autosampler und PDA Plus Detektor wurde mit ausgewählten Chromatographiesäulen und einer 100 µl Slipfree Injektionsschleife betrieben.

Die Detektion erfolgte mit dem iCAP 6500 ICP-OES Spektrometer [D. Marquardt, Nachrichten aus der Chemie 54 (2006) 1008] (Abb. 1).

Es wurde ein Burgener Mira Mist Zerstäuber und eine Zyklonsprühkammer eingesetzt. Der Zerstäuber besteht aus PEEK und ist nicht selbstansaugend.

Damit eignet er sich für die HPLC-ICP-OES-Kopplung und die untersuchten Analyten.

Alle genannten Geräte und Bauteile sind von ThermoFisher Scientific. Die Kopplung erfolgte durch direkte Überführung der Ausgangskapillare vom PDA-Detektor der HPLC in den Zerstäuber des ICP-OES-Spektrometers. Die Flussrate der HPLC wurde auf 1 ml/min eingestellt.

Das Ziel unserer Untersuchungen war die Analyse einer großen Anzahl an Metallen und der Metalloide.

Die ICP-OES bietet als Multielementmethode die Möglichkeit, alle zu untersuchenden Metalle in einer Messung in ihrem Gesamtgehalt zu erfassen.

Damit wird aber keine Aussage zur vorliegenden Spezies getroffen.

Es sollte in einer Screening-Methode eine weitestgehende Fraktionierung der Metalle, ein Schritt für später folgende Untersuchungen zur Trennung proteingebundener Metalle, vorgenommen und einzelne Metallspezies identifiziert werden.

Eine Quantifizierung auf der Basis dieser Methode wurde nicht angestrebt. Die Screening-­Methode stellt in Bezug auf die Messparameter für mehr als 30 Metalle und Metalloide lediglich einen Kompromiss dar, so dass die für eine Quantifizierung notwendige Sensitivität nicht erreicht wird.

Des Weiteren muss die Spezies­trennung in der Screening-Methode nicht vollständig sein, so dass in einer auf die zu untersuchenden Spezies abgestimmten Methode eine Quantifizierung vorgenommen werden könnte.

 

Optimierung

Bei jeder ICP-OES-Methode werden die optimalen Messparameter für die zu untersuchenden Elemente für die Plasmabedingungen und Pumprate eingestellt. Da in diesem Fall eine große Anzahl an Elementen mit sehr unterschiedlichen Anregungsenergien untersucht wurde, ­erfolgte zunächst die Optimierung der Plasmabedingungen.

Die Pumprate wurde dabei auf 25 rpm eingestellt, die einer Flussrate von ca. 1 ml/min entspricht. Die Optimierung der Gasströme (Plasmagas, Hilfsgas und Zerstäubergas, jeweils Argon) sowie der Generatorleistung wurde zum einen mit Hilfe eines statistischen Versuchsplans in Form eines Box-Behnken-Designs (1 Block, 15 Versuche, randomisiert) sowie der softwareinternen Optimierung durchgeführt.

Die Beobachtung des Plasmas erfolgte jeweils axial.

Beide Optimierungen führten zum selben Ergebnis: Für die ­Untersuchungen mit der HPLC-ICP-OES-Kopplung wurden eine Generatorleistung von 1.200 W, ein Plasmagasstrom von 12 l/min und ein Zerstäuber- sowie Hilfsgasstrom von 0,5 l/min eingestellt. Es zeigte sich, dass besonders der Zerstäubergasstrom einen signifikanten Einfluss auf die Messungen hatte. Der Einfluss der Generatorleistung und des Hilfsgasstroms waren für die betrachteten Elemente unterschiedlich stark.

Zusätzlich zu den bisher genannten Faktoren wurde die Zeit pro Scheibe, die bei Kopplungsmessungen eingestellt werden muss, betrachtet. Die Untersuchungen zeigten, dass bei der Erhöhung der Zeit von 1 auf 3 Sekunden die ­Flächenwerte einiger Elemente stark abnahmen, außerdem wurden bei schmalen Peaks die Spitzen ­abgeschnitten. Aufgrund dieser ­Erkenntnisse und der Tatsache, dass die HPLC-Datenaufnahme mit 10 Hz erfolgt, wurde die Zeit pro Scheibe auf 1 Sekunde festgelegt.


Screening-Methode

Da die Screening-Methode sowohl Anionen als auch Kationen erfassen soll (Tab. 1), wurde die Ionenpaarchromatographie auf Umkehrphasen mit gemischten ­Ionenpaarreagenzien gewählt. Es wurden unterschiedliche Probenvorbereitungen, mobile Phasen mit verschiedenen Komplexbildnern, Ionenpaarreagenzien in unterschiedlicher Kombination und Konzentration, organische Modifier, bei unterschiedlichen pH-Werten in isokratischer und Gradientenelution getestet.

Die einzelnen Parameter der erarbeiteten Screening-­Methode sind im Folgenden zusammengefasst:

Probenvorbereitung: Die aus den handelsüblichen Elementstandardlösungen hergestellten Metallstammlösungen mit 1.000 - 2.000 µg/l (je nach betrachtetem Element) wurden im Volumenverhältnis von 5:1 mit 1 mM EDTA-Lösung versetzt und für 2 Stunden auf 80 °C ­erwärmt.

Stationäre Phase: Es wurde eine Sunfire C18 mit 5 µm Partikeldurchmesser (Waters) verwendet.

Mobile Phase: Der Eluent enthält 0,5 mM Natriumbutansulfonat, 0,5 mM Tetrabutylammoniumhydroxid, 2,5 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat, 2,5 mM Benzendisulfonsäure und 1 mM EDTA. Der pH-Wert wurde entsprechend der Anwendung variiert. Für einige Elemente erwies sich ein pH-Wert von 4 günstiger, andere Spezies konnten nur bei pH 7 eindeutig ­getrennt werden.


Applikationen

Die Screening-Methode auf der ­Basis der IP-RP-HPLC-ICP-OES wurde neben der Untersuchung der Fraktionierung von mehr als 30 Metallen auf verschiedene Speziestrennungen angewendet. So konnten Antimon(III) und Antimon(V) in ­einem Mineral ­nebeneinander identifiziert werden (Abb. 2).

Bei dieser Analyse wurde ein pH-Wert von 4 eingestellt, da die Spezies nur in salzsaurem ­Medium stabil sind und sonst hydrolysieren. Die Trennung von Chrom(III) und Chrom(VI), eine sehr häufig untersuchte Speziestrennung, führte bei einem pH-Wert von 7 zur eindeutigen Trennung der Spezies (Abb. 3). ­Neben den anorganischen Spezies wurde die Trennung von fünf Phenylarsenverbindungen untersucht.

Eine erfolgreiche Trennung wurde bei pH 4 und einer Flussrate von 1,65 ml/min erhalten (Abb. 4).

 

Autoren:
Heike Brandt,
TU Bergakademie Freiberg
Dr. Silke Tesch,
TU Bergakademie Freiberg
Prof. Dr. Matthias Otto,
TU Bergakademie Freiberg

 

Kontakt

Dr. Silke Tesch
Institut für Analytische Chemie
TU Bergakademie Freiberg
Tel.: 03731/39-2281
Fax: 03731/39-3666
silke.tesch@chemie.tu-freiberg.de

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